Het belangrijkste verschil tussen nick-translatie en end-filling is dat nick-translatie een proces is dat gelabelde DNA-probes maakt voor verschillende hybridisatiereacties, terwijl end-filling een techniek is die stompe fragmenten creëert door nucleotiden toe te voegen aan enkelstrengige overhangen.
Nick-vertaling en eindvulling zijn twee technieken die worden gebruikt in de moleculaire biologie. Nick-translatie wordt gebruikt voor het labelen van probes voor hybridisatie om specifieke nucleotidesequenties te detecteren. Eindvulling wordt gebruikt om stompe fragmenten te maken die kleverige uiteinden hadden met enkelstrengs uitsteeksels. Beide technieken zijn van groot belang en worden routinematig uitgevoerd in moleculaire onderzoekslaboratoria.
Wat is Nick Translation?
Nick-translatie is een belangrijke techniek die wordt gebruikt om gelabelde probes te bereiden voor verschillende moleculair-biologische technieken zoals blotting, in situ hybridisatie, fluorescente in situ hybridisatie, enz. Het is een in vitro methode voor DNA-labeling. DNA-probes worden gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties te identificeren. Met behulp van een gelabelde probe kunnen specifieke fragmenten worden gemarkeerd of gevisualiseerd uit een complex mengsel van nucleïnezuur. Daarom worden gelabelde probes bereid met behulp van verschillende technieken. Nick-translatie is zo'n methode die gelabelde probes produceert met behulp van DNase 1- en DNA-polymerase 1-enzymen.
Figuur 01: Nick-vertaling
Nick-translatieproces begint met DNase 1-enzymactiviteit. DNase 1 introduceert inkepingen in de fosfaatruggengraat van dubbelstrengs DNA door fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden te splitsen. Zodra de inkeping is gemaakt, wordt de vrije 3'-OH-groep van het nucleotide geproduceerd en zal het DNA-polymerase 1-enzym erop inwerken. 5' tot 3' exonuclease-activiteit van DNA-polymerase 1 verwijdert nucleotiden van de inkeping naar de 3'-richting van de DNA-streng.
Tegelijkertijd werkt de polymerase-activiteit van het DNA-polymerase 1-enzym en voegt het nucleotiden toe om de verwijderde nucleotiden te vervangen. Als de nucleotiden zijn gelabeld, vindt de vervanging plaats door de gelabelde nucleotiden en wordt het DNA gemarkeerd voor identificatie. Ten slotte kan dit nieuw gesynthetiseerde gelabelde DNA worden gebruikt als probes in verschillende hybridisatiereacties.
Wat is eindvulling?
End-filling is een techniek die in de moleculaire biologie wordt gebruikt om botte fragmenten te maken. Restrictiedigestie produceert fragmenten met uitsteeksels. Deze fragmenten zijn mogelijk niet compatibel om in plasmidevectoren te ligeren. Vectoren zijn vaak afgestompt om niet-compatibele uiteinden te kunnen verbinden. Daarom kunnen fragmenten met overhangen worden afgestompt door de nucleotiden toe te voegen aan de complementaire streng met behulp van de overhang als sjabloon voor polymerisatie. Dit proces staat bekend als eindvulling.
DNA-polymerasen zoals Klenow-fragment van DNA-polymerase I en T4 DNA-polymerase katalyseren de eindvulling. Ze voegen nucleotiden toe om in te vullen (5′ → 3′) en terug te kauwen (3′ → 5′). Zodra de plakkerige uiteinden zijn gevuld, worden ze bot en zijn ze klaar om in een vector te worden geligeerd.
Bovendien kan eindvulling worden gebruikt om DNA-moleculen te labelen. Het kan echter alleen worden gebruikt om DNA-moleculen met plakkerige uiteinden te labelen. In vergelijking met nick-translatie is end-filling een zachtere methode die zelden DNA-breuken veroorzaakt.
Wat zijn de overeenkomsten tussen Nick Translation en End Filling?
- Zowel nick-translatie als eindvulling zijn moleculair biologische technieken.
- Ze kunnen worden gebruikt om sondes te labelen.
- Beide zijn in vitro
Wat is het verschil tussen Nick Translation en End Filling?
Nick-translatie is een techniek die gelabelde probes maakt voor hybridisatie. Daarentegen is eindvulling een techniek die stompe fragmenten creëert voor ligatie in vectoren. Dit is dus het belangrijkste verschil tussen nick-vertaling en eindvulling. Bovendien vereist Nick-translatie het gebruik van 5'tot 3'-exonuclease-activiteit, terwijl eindvulling geen 5'tot 3'-exonuclease-activiteit vereist.
De onderstaande infographic geeft de verschillen tussen nick-vertaling en einde-invulling in meer detail weer.
Samenvatting – Nick-vertaling versus eindvulling
Nick-translatie is een methode waarbij radioactief gelabelde nucleotiden in DNA worden opgenomen. Het synthetiseert gelabelde probes op basis van de activiteiten van DNase 1- en E. coli DNA-polymerase 1-enzymen. Endfilling daarentegen is een techniek die stompe fragmenten produceert. Wanneer de fragmenten kleverige uiteinden hebben (enkelstrengige overhangen), is het noodzakelijk om ze stompe uiteinden te maken om in vectoren te ligeren. Eindvulling voegt compatibele nucleotiden toe en creëert stompe eindfragmenten om ze compatibel te maken voor ligatie. Dit vat dus het verschil samen tussen nick-vertaling en eindvulling.
