Belangrijk verschil – Nick Translation vs Primer Extension
Nick-translatie en primerverlenging zijn twee belangrijke technieken die worden uitgevoerd in de moleculaire biologie. Het belangrijkste verschil tussen nick-translatie en primerverlenging is dat het nick-translatieproces gelabelde probes produceert voor andere hybridisatietechnieken, terwijl de primerverlengingsmethode een specifieke RNA-sequentie uit een mengsel identificeert en informatie onthult over de expressie van mRNA. Beide technieken zijn van groot belang en worden routinematig uitgevoerd in moleculaire onderzoekslaboratoria.
Wat is Nick Translation?
Nick-translatie is een belangrijke techniek die wordt gebruikt om gelabelde probes te bereiden voor verschillende moleculair biologische technieken zoals blotting, in situ hybridisatie, fluorescente in situ hybridisatie enz. Het is een in vitro methode van DNA-labeling. DNA-probes worden gebruikt om specifieke DNA- of RNA-sequenties te identificeren. Met behulp van een gelabelde probe kunnen specifieke fragmenten worden gemarkeerd of gevisualiseerd uit een complex mengsel van nucleïnezuur. Daarom worden gelabelde probes bereid met behulp van verschillende technieken die voor verschillende technieken kunnen worden gebruikt. Nick-translatie is zo'n methode die gelabelde probes produceert met behulp van DNase 1- en DNA-polymerase 1-enzymen.
Het nick-translatieproces begint met DNase 1-enzymactiviteit. DNase 1 introduceert inkepingen in de fosfaatruggengraat van dubbelstrengs DNA door fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden te splitsen. Zodra de inkeping is gemaakt, wordt een vrije 3'-OH-groep van het nucleotide gevormd en zal het DNA-polymerase 1-enzym erop inwerken. 5' naar 3' exonuclease-activiteit van DNA-polymerase 1 verwijdert nucleotiden van de inkeping naar de 3'-richting van de DNA-streng. Tegelijkertijd werkt de polymerase-activiteit van het DNA-polymerase 1-enzym en voegt het nucleotiden toe om de verwijderde nucleotiden te vervangen. Als de nucleotiden gelabeld waren, zal de vervanging plaatsvinden door de gelabelde nucleotiden en het zal het DNA markeren voor identificatie. Dit nieuw gesynthetiseerde gelabelde DNA kan worden gebruikt als probes in verschillende hybridisatiereacties in Molecular Biology.
Figuur 01: Nick-vertaalproces
Wat is Primer Extension?
Primerverlenging is een techniek die wordt gebruikt om een specifieke RNA-sequentie uit een RNA-mengsel te vinden en het 5'-uiteinde van het mRNA-transcript te lokaliseren. Het wordt ook gebruikt om de structuur van RNA en expressie te bestuderen. De primerverlengingsmethode wordt uitgevoerd met gelabelde primers of met gelabelde nucleotiden. Als gelabelde primers worden gebruikt, sluit dit de noodzaak uit van het labelen van de nucleotiden die worden gebruikt voor de synthese van cDNA. Er zijn verschillende stappen in deze techniek. Het begint met extractie van RNA uit het monster. Vervolgens wordt een gelabelde oligonucleotideprimer aan het mengsel toegevoegd samen met de noodzakelijke ingrediënten om cDNA van een specifieke RNA-sequentie te synthetiseren. Primer anneals met de complementaire volgorde van het mengsel. Gebruikmakend van de primer-aangepaste sequentie als de matrijs, synthetiseert het enzym reverse transcriptase het complementaire DNA (cDNA) van de RNA-sequentie. Primer-annealing en reverse transcriptie vinden alleen plaats wanneer de specifieke RNA-sequentie in het monster aanwezig is. Ten slotte, wanneer denaturerende gelelektroforese wordt uitgevoerd, kan de grootte van de RNA-sequentie worden bepaald. Het is ook gemakkelijk om de +1-base van de mRNA-sequentie (transcriptie-initiatieplaats) te vinden met de primerverlengingsmethode. De hoeveelheid mRNA die in het monster aanwezig is, kan met deze methode worden gekwantificeerd als er een overmaat aan primer wordt gebruikt.
Figuur 02: Primerverlenging
Wat is het verschil tussen Nick Translation en Primer Extension?
Nick Translation vs Primer Extension |
|
| Nick-translatie is een proces dat gelabelde DNA-probes creëert voor verschillende hybridisatiereacties. | Primerextensie is een techniek die wordt gebruikt om specifiek RNA te vinden of om genexpressie te bestuderen. |
| Gebruikte enzymen | |
| DNase 1 en DNA-polymerase-enzymen worden gebruikt. | Reverse transcriptase-enzym wordt gebruikt. |
| Belang | |
| Nick-vertaling vergemakkelijkt het markeren van een specifieke DNA-sequentie. | Primer-extensie maakt detectie mogelijk van specifieke mRNA-sequentiegrootte en de hoeveelheid die in het monster aanwezig is. |
Samenvatting – Nick Translation vs Primer Extension
Nick-translatie is een methode die wordt gebruikt om gelabelde probes te synthetiseren op basis van de activiteiten van DNase 1- en E coli DNA-polymerase 1-enzymen. Het is een in vitro methode die in de laboratoria wordt gebruikt voorafgaand aan verschillende hybridisatietechnieken. Tijdens de nick-translatie verwijdert 5'-3'-exonuclease-activiteit van DNA-polymerase 1 nucleotiden vóór de inkeping en polymerase-activiteit van DNA-polymerase 1 vervangt de verwijderde nucleotiden door gelabelde nucleotiden achter de inkeping. Primer-extensie is een methode die wordt gebruikt om een specifiek RNA-transcript uit een mengsel te detecteren en de grootte en de hoeveelheid van het interesse-RNA te kwantificeren. Dit is het verschil tussen nick-translatie en primer-extensie.
