Belangrijk verschil - Sanger-sequencing versus pyrosequencing
DNA-sequencing is erg belangrijk voor DNA-analyse, omdat kennis van de juiste nucleotide-rangschikking op een bepaald DNA-gebied veel belangrijke informatie erover onthult. Er zijn verschillende methoden voor DNA-sequencing. Sanger-sequencing en Pyrosequencing zijn twee verschillende DNA-sequencingmethoden die veel worden gebruikt in de moleculaire biologie. Het belangrijkste verschil tussen Sanger-sequencing en Pyrosequencing is dat Sanger-sequencing dideoxynucleotiden gebruikt om de synthese van DNA te beëindigen om de nucleotidesequentie te lezen, terwijl pyrosequencing de pyrofosfaatafgifte detecteert door de nucleotiden op te nemen en de complementaire sequentie te synthetiseren om de precieze volgorde van de sequentie te lezen.
Wat is Sanger-sequencing?
Sanger-sequencing is een methode voor DNA-sequencing van de eerste generatie, ontwikkeld door Frederick Sanger en zijn colleges in 1977. Het staat ook bekend als Chain Termination Sequencing of Dideoxy-sequencing, omdat het gebaseerd is op ketenbeëindiging door dideoxynucleotiden (ddNTP's). Deze methode werd meer dan 30 jaar veel gebruikt totdat de New Generation Sequencing (NGS) werd ontwikkeld. De Sanger-sequencingtechniek maakte de ontdekking van de juiste nucleotidevolgorde of de aanhechting van een bepaald DNA-fragment mogelijk. Het is gebaseerd op de selectieve opname van ddNTP's en beëindiging van de DNA-synthese tijdens de in vitro DNA-replicatie. De afwezigheid van 3'-OH-groepen om de vorming van fosfodiesterbindingen tussen aangrenzende nucleotiden voort te zetten, is een uniek kenmerk van ddNTP's. Dus zodra de ddNTP is bevestigd, stopt de ketenverlenging en eindigt vanaf dat punt. Er zijn vier ddNTP's - ddATP, ddCTP, ddGTP en ddTTP - die worden gebruikt in Sanger-sequencing. Deze nucleotiden stoppen het DNA-replicatieproces wanneer ze worden opgenomen in de groeiende DNA-streng en resulteren in verschillende lengtes van kort DNA. Capillaire gelelektroforese wordt gebruikt om deze korte DNA-strengen op basis van hun grootte op een gel te ordenen, zoals weergegeven in figuur 01.
Figuur 1: Capillaire gelelektroforese van gesynthetiseerd kort DNA
Voor in vitro replicatie van DNA moeten er weinig vereisten worden gesteld. Het zijn DNA-polymerase-enzym, matrijs-DNA, oligonucleotide-primers en deoxynucleotiden (dNTP's). Bij Sanger-sequencing wordt DNA-replicatie uitgevoerd in vier afzonderlijke reageerbuizen, samen met vier soorten ddNTP's afzonderlijk. Deoxynucleotiden worden niet volledig vervangen door de respectieve ddNTP's. Een mengsel van de bepaalde dNTP (bijvoorbeeld; dATP + ddATP) wordt in de buis opgenomen en gerepliceerd. Vier afzonderlijke buisproducten worden op een gel in vier afzonderlijke putjes gelopen. Door de gel te lezen, kan de sequentie worden geconstrueerd zoals weergegeven in figuur 02.
Figuur 02: Sanger-sequencing
Sanger-sequencing is een belangrijke techniek die helpt op veel gebieden van de moleculaire biologie. Het menselijk genoomproject is succesvol afgerond met behulp van op Sanger sequencing gebaseerde methoden. Sanger-sequencing is ook nuttig bij doel-DNA-sequencing, onderzoek naar kanker en genetische ziekten, genexpressie-analyse, menselijke identificatie, detectie van pathogenen, microbiële sequencing enz.
Er zijn verschillende nadelen van Sanger-sequencing:
- De lengte van het DNA waarvan de sequentie wordt bepaald, mag niet langer zijn dan 1000 basenparen
- Er kan slechts één streng tegelijk worden gesequenced.
- Het proces is tijdrovend en duur.
Daarom werden in de loop van de tijd nieuwe geavanceerde sequencing-technieken ontwikkeld om deze problemen te overwinnen. Sanger-sequencing wordt echter nog steeds gebruikt vanwege de zeer nauwkeurige resultaten tot fragmenten met een lengte van ongeveer 850 basenparen.
Wat is Pyrosequencing?
Pyrosequencing is een nieuwe DNA-sequencingtechniek gebaseerd op de "sequencing door synthese". Deze techniek berust op de detectie van pyrofosfaatafgifte bij de opname van nucleotiden. Het proces wordt gebruikt door vier verschillende enzymen: DNA-polymerse, ATP-sulfarylase, luciferase en apyrase en twee substraten adenosine 5'-fosfosulfaat (APS) en luciferine.
Het proces begint met de binding van de primer met de enkelstrengs DNA-matrijs en DNA-polymerase begint met de opname van nucleotiden die er complementair aan zijn. Wanneer de nucleotiden samenkomen (nucleïnezuurpolymerisatie), geeft het pyrofosfaatgroepen (twee aan elkaar gebonden fosfaatgroepen) en energie vrij. Bij elke toevoeging van nucleotiden komt een equimolaire hoeveelheid pyrofosfaat vrij. Pyrofosfaat wordt omgezet in ATP door ATP-sulforylase in aanwezigheid van substraat APS. De gegenereerde ATP drijft de door luciferase gemedieerde omzetting van luciferine naar oxyluciferine aan, waarbij zichtbaar licht wordt geproduceerd in hoeveelheden die evenredig zijn aan de hoeveelheid ATP's. Licht wordt gedetecteerd door een fotondetectie-apparaat of door een fotomultiplier en creëert een pyrogram. Apyrase breekt ATP en niet-opgenomen dNTP's in het reactiemengsel af. dNTP-toevoeging wordt één voor één gedaan. Aangezien de toevoeging van nucleotide bekend is volgens de inbouw en detectie van licht, kan de sequentie van de matrijs worden bepaald. Pyrogram wordt gebruikt voor het genereren van de nucleotidesequentie van het DNA-monster, zoals weergegeven in afbeelding 03.
Pyrosequencing is erg belangrijk bij de analyse van polymorfisme van één nucleotide en het sequencen van korte stukken DNA. De hoge nauwkeurigheid, flexibiliteit, het gemak van automatisering en parallelle verwerking zijn de voordelen van pyrosequencing ten opzichte van Sanger-sequencing-technieken.
Figuur 03: Pyrosequencing
Wat is het verschil tussen Sanger Sequencing en Pyrosequencing?
Sanger-sequencing versus pyrosequencing |
|
| Sanger-sequencing is een DNA-sequencingmethode die is gebaseerd op de selectieve opname van ddNTP's door DNA-polymerase en ketenbeëindiging. | Pyrosequencing is een methode voor DNA-sequencing gebaseerd op de detectie van het vrijkomen van pyrofosfaat bij de opname van nucleotide. |
| Gebruik van ddNTP | |
| ddNTP's worden gebruikt om de DNA-replicatie te beëindigen | ddNTP's worden niet gebruikt. |
| Enzymen betrokken | |
| DNA-polymerase wordt gebruikt. | Er worden vier enzymen gebruikt: DNA-polymerase, ATP-sulforylase, Luciferase en Apyrase. |
| Gebruikte substraten | |
| APS en Luciferine worden niet gebruikt. | Adenosine 5'-fosfosulfaat (APS) en luciferine worden gebruikt. |
| Maximale temperatuur | |
| Dit is een langzaam proces. | Dit is een snel proces. |
Samenvatting – Sanger-sequencing versus pyrosequencing
Sanger-sequencing en Pyrosequencing zijn twee DNA-sequencingmethoden die worden gebruikt in de moleculaire biologie. Sanger-sequencing construeert de volgorde van de nucleotiden in volgorde door de ketenverlenging te beëindigen, terwijl pyrosequencing de precieze volgorde van de nucleotiden in volgorde construeert door nucleotiden op te nemen en de afgifte van pyrofosfaten te detecteren. Daarom is het belangrijkste verschil tussen Sanger-sequencing en Pyrosequencing dat Sanger-sequencing werkt op sequencing door ketenbeëindiging, terwijl pyrosequencing werkt op sequencing door synthese.
