Het belangrijkste verschil tussen clone by clone-sequencing en shotgun-sequencing ligt in hun gedragsmethode. Clone by clone sequencing-methode omvat het in kaart brengen van chromosomen en klonen voorafgaand aan sequencing, terwijl clone by shotgun-sequencing zowel chromosoommapping als kloneringsstappen tijdens de sequencing weglaat.
Clone by clone sequencing en clone by shotgun sequencing zijn twee methoden voor moderne genoomsequencing. Clone by clone sequencing is een betrouwbaardere methode voor sequencing. De methode van klonen door shotgun-sequencing is echter sneller en goedkoper. Het artikel richt zich op het subtiele verschil tussen clone by clone sequencing en shotgun sequencing.
Wat is Clone by Clone Sequencing?
Clone by clone sequencing is een methode voor genoomsequencing. Het vereist het in kaart brengen van elk chromosoom voorafgaand aan DNA-splitsing. Na het in kaart brengen moet het DNA worden afgebroken tot fragmenten van 150 kilobasen lang. Deze fragmenten zijn dan klaar voor sequencing. De volgende stap is het inbrengen van DNA-fragmenten in bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC's) en vervolgens in bacteriële cellen. Omdat de fragmenten zich nu in de bacteriecellen bevinden, delen de ingevoegde DNA-fragmenten zich ook bij elke keer dat de bacteriën zich delen en produceren ze veel identieke kopieën. Vervolgens wordt het individuele bacteriële kloon-DNA gefragmenteerd in fragmenten van 500 basenparen. Het zijn kleinere en overlappende fragmenten. Vervolgens vindt de sequencing plaats met het inbrengen van deze fragmenten in een vector met een bekende DNA-sequentie. Uitgaande van de bekende sequentie van de vector, gaat de sequentiebepaling door tot onbekende sequentie.
Na het voltooien van de reeksen, is het noodzakelijk om de gebieden met overlappende reeksen te identificeren. Daarna vindt het samenvoegen van de fragmenten plaats om de grotere fragmenten te vormen die aanvankelijk in BAC's werden gepresenteerd. Vervolgens vindt de assemblage van grotere fragmenten in het chromosoom plaats volgens de genoomkaart.
Figuur 01: Clone by Clone Sequencing
Het belangrijke voordeel van clone by clone sequencing is dat de vooraf voorbereide genoomkaart een betrouwbare assemblage van grotere fragmenten helpt. Maar het nadeel van deze sequencing-methode is dat het tijdrovend is om genoomkaarten te genereren en klonen te maken. Dit was echter de methode die de voorkeur had tijdens het ‘Human Genome Project’.
Wat is Clone by Shotgun Sequencing?
Clone by shotgun-sequencing is een sequentiëringsmethode die DNA-sequenties willekeurig in vele kleine fragmenten opsplitst en de sequentie opnieuw samenstelt door de overlappende gebieden te observeren. Grotere zoogdiergenomen zijn moeilijk te klonen sequentie en assembleren. Het is te wijten aan hun structurele complexiteit en grootte. Hoewel de clone by clone sequencing-methode betrouwbaar is, duurt het lang om genomen van complexe organismen te sequensen. Daarom is clone by shotgun-sequencing een betrouwbare, goedkopere sequencing-methode geworden die sneller kan worden uitgevoerd. Daarom vertrouwen hedendaagse wetenschappers op deze sequentiemethode om complexe genomen aan te pakken.
Figuur 02: Kloon door Shotgun Sequencing
Tijdens kloon door shotgun-sequencing-methode vinden er geen conventionele genoommapping- en kloonstappen plaats. Aanvankelijk is het hele genoom gefragmenteerd in verschillende groottes van 20 kilobasen tot 300 kilobasen. Vervolgens vindt sequencing plaats. Vervolgens is het met behulp van geavanceerde computersoftware nodig om de fragmenten samen te voegen door naar de overlappende gebieden te kijken.
Clone by shotgun-sequencing helpt de nauwkeurigheid van bestaande genoomsequenties te verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het een veel snellere en goedkopere methode is dan clone by clone sequencing. Bij dit proces wordt echter geen genetische kaart gebruikt. Daarom is de kans groter dat fouten tijdens de assemblage optreden. Dit is dus een groot nadeel bij clone by shotgun sequencing-methode.
Wat zijn de overeenkomsten tussen Clone by Clone Sequencing en Shotgun Sequencing?
- Zowel kloon door kloonsequencing als shotgun-sequencing zijn twee methoden voor genoomsequencing.
- Tijdens beide sequentietechnieken vindt assemblage van afgebroken fragmenten plaats door overlappende regio's te identificeren.
- De afbraak van DNA in kleinere fragmenten is ook nodig voor zowel kloon- als shotgun-sequencing.
Wat is het verschil tussen Clone by Clone Sequencing en Shotgun Sequencing?
Clone by clone sequencing-techniek omvat twee belangrijke stappen: het in kaart brengen van chromosomen en klonen. Daarentegen volgt clone by shotgun-sequencing deze twee stappen niet; het splitst willekeurig DNA-sequenties op in vele kleine fragmenten en assembleert de sequentie opnieuw door de overlappende gebieden te observeren. Daarom is dit het belangrijkste verschil tussen kloon door kloonsequencing en shotgun-sequencing. Vanwege deze factor is klonen door klonen sequencing een duur en tijdrovend proces, terwijl klonen door shotgun sequencing sneller en goedkoper is.
Het is echter minder waarschijnlijk dat fouten tijdens de montage optreden tijdens clone by clone sequencing. Daarom heeft het een hoge betrouwbaarheid. Kloon door shotgun-sequencing is echter een relatief minder betrouwbare techniek. Dit is dus ook een significant verschil tussen clone by clone sequencing en shotgun sequencing.
De onderstaande info-graphic geeft meer informatie over het verschil tussen clone by clone sequencing en shotgun sequencing.
Samenvatting – Clone by Clone Sequencing vs Shotgun Sequencing
Bij het samenvatten van het verschil tussen kloon door kloonsequencing en shotgun-sequencing, zijn de kloon door kloonsequencing en shotgun-sequencing twee methoden voor genoomsequencing. De techniek van clone by clone-sequencing omvat echter zowel genoommapping als kloneringsprocessen, terwijl clone by shotgun-sequencing dat niet doet. Dit is dus het belangrijkste verschil tussen kloon-door-kloon-sequencing en shotgun-sequencing. Omdat het in kaart brengen van het genoom plaatsvindt tijdens kloon door middel van kloonsequencing, is het minder waarschijnlijk dat fouten optreden tijdens het samenstellen van sequenties. Maar clone by shotgun sequencing is een veel sneller en goedkoper proces. Toch is het relatief minder betrouwbaar. Clone by clone sequencing was de geprefereerde sequencingmethode tijdens het 'Human Genome Project'. Maar de hedendaagse moleculair bioloog vertrouwt meer op clone by shotgun sequencing.
