Belangrijk verschil – NGS vs Sanger-sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) en Sanger Sequencing zijn twee soorten nucleotidesequencing-technieken die in de loop van de tijd zijn ontwikkeld. De Sanger Sequencing-methode werd jarenlang op grote schaal gebruikt en NGS heeft deze onlangs vervangen vanwege de voordelen ervan. Het belangrijkste verschil tussen NGS en Sanger Sequencing is dat NGS werkt volgens het principe van het snel sequencen van miljoenen sequenties tegelijk via een sequencingsysteem, terwijl de Sanger-sequencing werkt op het principe van ketenbeëindiging als gevolg van selectieve opname van dideoxynucleotiden door DNA-polymerase-enzym tijdens de DNA-replicatie en resulterende fragmentscheiding door capillaire elektroforese.
Wat is Nucleotide Sequencing?
Genetische informatie wordt opgeslagen in de nucleotidesequenties van het DNA of RNA van een organisme. Het proces van het bepalen van de juiste volgorde van nucleotiden (met behulp van vier basen) in een bepaald fragment (in een gen, cluster van genen, chromosoom en compleet genoom) staat bekend als nucleotidesequencing. Het is erg belangrijk in genomische studies, forensische studies, virologie, biologische systematiek, medische diagnose, biotechnologie en op vele andere gebieden om de structuur en functie van genen te analyseren. Er zijn verschillende soorten sequencing-methoden ontwikkeld door wetenschappers. Onder hen werd Sanger-sequencing, ontwikkeld door Frederick Sanger in 1977, op grote schaal gebruikt en gepopulariseerd gedurende een lange periode totdat Next Generation Sequencing het verving.
Wat is NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) is een term die wordt gebruikt om te verwijzen naar moderne high-throughput sequencing-processen. Het beschrijft een aantal verschillende moderne sequencing-technologieën die een revolutie teweeg hebben gebracht in genomische studies en moleculaire biologie. Die technieken zijn Illumina-sequencing, Roche 454-sequencing, Ion Proton-sequencing en SOLiD-sequencing (Sequencing door Oligo Ligation Detection). NGS-systemen zijn sneller en goedkoper. Vier hoofdmethoden voor DNA-sequentiebepaling worden gebruikt in NGS-systemen, namelijk; pyrosequencing, sequencing door synthese, sequencing door ligatie en ionenhalfgeleidersequencing. Een groot aantal DNA- of RNA-strengen (miljoenen) kunnen parallel worden gesequenced. Het maakt sequencing van het gehele genoom van organismen binnen een korte tijdsperiode mogelijk, in tegenstelling tot Sanger-sequencing die meer tijd kost.
NGS heeft veel voordelen ten opzichte van de conventionele Sanger-sequencingmethode. Het is een snel, nauwkeuriger en kosteneffectief proces dat met een kleine steekproefomvang kan worden uitgevoerd. NGS kan worden gebruikt in metagenomische studies, bij de detectie van variaties binnen een individueel genoom als gevolg van inserties en deleties enz. en bij de analyse van genexpressies.
Figuur_1: Ontwikkelingen in NGS Sequencing
Wat is Sanger-sequencing?
Sanger Sequencing is een sequentiemethode die in 1977 door Frederick Sanger en zijn collega's is ontwikkeld om de precieze nucleotidevolgorde van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Het is ook bekend als ketenbeëindiging-sequencing of Dideoxy-sequencing. Het werkingsprincipe van deze methode is de beëindiging van strengsynthese door selectieve opname van een ketenbeëindigende dideoxynucleotiden (ddNTP's) zoals ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP door DNA-polymerase tijdens de replicatie van DNA. Normale nucleotiden hebben 3'-OH-groepen voor de vorming van een fosfodiesterbinding tussen aangrenzende nucleotiden om de strengvorming voort te zetten. ddNTP's missen deze 3'-OH-groep echter en kunnen geen fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden vormen. Daarom wordt de kettingverlenging stopgezet.
Bij deze methode dient het enkelstrengs DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald, als de matrijsstreng voor in vitro DNA-synthese. Andere vereisten zijn oligonucleotide-primer, deoxynucleotide-precursoren en DNA-polymerase-enzym. Wanneer de flankerende uiteinden van het doelfragment bekend zijn, kunnen primers gemakkelijk worden ontworpen voor DNA-replicatie. Vier afzonderlijke DNA-synthesereacties worden uitgevoerd in vier afzonderlijke buizen. Elke buis heeft aparte ddNTP's, samen met andere vereisten. Van het specifieke nucleotide wordt een mengsel van dNTP's en ddNTP's toegevoegd. Evenzo worden vier afzonderlijke reacties uitgevoerd in vier buizen met vier mengsels. Na de reacties vindt de detectie van DNA-fragmenten en de omzetting van het fragmentpatroon in sequentie-informatie plaats. Resulterende DNA-fragmenten worden met warmte gedenatureerd en gescheiden door gelelektroforese. Als radioactieve nucleotiden worden gebruikt, kan het bandpatroon in de polyacrylamidegel worden gevisualiseerd door autoradiografie. Wanneer deze methode de fluorescent gelabelde dideoxynucleotiden gebruikt, kan deze worden verzacht door de gel te lezen en door een laserstraal te gaan om te worden gedetecteerd door de fluorescente detector. Om fouten te voorkomen die kunnen optreden wanneer een sequentie met het oog wordt gelezen en handmatig in een computer wordt ingevoerd, ontwikkelde deze methode zich tot het gebruik van een geautomatiseerde sequencer in combinatie met de computer.
Dit is de methode die wordt gebruikt om DNA van het Human Genome-project te sequencen. Deze methode wordt nog steeds gebruikt met geavanceerde aanpassingen omdat het nauwkeurige sequentie-informatie geeft ondanks dat het een duur en langzaam proces is.
Figuur_2: Sanger-reeksen
Wat is het verschil tussen NGS en Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) verwijst naar moderne high-throughput sequencing-processen. Het beschrijft een aantal verschillende moderne sequencing-technologieën | Sanger Sequencing is een sequencing-methode die is ontwikkeld door Frederick Sanger om de precieze nucleotidevolgorde van een bepaald DNA-fragment te bepalen. |
| Kosteneffectiviteit | |
| NGS is een goedkoper proces omdat het tijd, mankracht en chemicaliën vermindert. | Dit is een kostbaar proces omdat het tijd, mankracht en meer chemicaliën kost. |
| Snelheid | |
| Dit is sneller omdat zowel chemische detectie als signaaldetectie van veel strengen parallel plaatsvinden. | Dit is tijdrovend omdat chemische detectie en signaaldetectie plaatsvinden als twee afzonderlijke processen en alleen op streng tegelijk kan worden gelezen. |
| Betrouwbaarheid | |
| NGS is betrouwbaar. | Sanger-sequencing is minder betrouwbaar |
| Monstergrootte | |
| NGS vereist minder DNA. | Deze methode heeft een grote hoeveelheid template-DNA nodig. |
| DNA-basen per sequentiefragment | |
| Het aantal DNA-basen per fragment waarvan de sequentie is bepaald, is lager dan de Sanger-methode | Genererende sequenties zijn langer dan NGS-sequenties. |
Samenvatting – NGS vs Sanger-sequencing
NGS en Sanger Sequencing zijn technieken voor nucleotidesequencing die veel worden gebruikt in de moleculaire biologie. Sanger-sequencing is een vroege sequencing-methode die werd vervangen door NGS. Het belangrijkste verschil tussen NGS en Sanger-sequencing is dat NGS een snel, nauwkeuriger en kosteneffectiever proces is dan Sanger-sequencing. Beide technieken zorgden voor grote uitbraken in genetica en biotechnologie.
