Belangrijk verschil – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Nucleotiden zijn de structurele basiseenheden en bouwstenen van DNA. DNA-molecuul is samengesteld uit een polynucleotideketen. Er zijn vier verschillende nucleotiden gevonden in DNA. Deze nucleotiden zijn samengesteld uit vier verschillende stikstofbasen genaamd A (adenine), G (guanine), C (cytosine), T (thymine). De volgorde van de nucleotiden in het DNA-molecuul is van groot belang omdat het codeert voor belangrijke genetische informatie voor de groei en ontwikkeling van organismen. DNA-sequencing verwijst naar het proces dat de precieze nucleotidesequentie van het DNA bepa alt. Er zijn verschillende methoden voor DNA-sequencing. Maxam Gilbert-sequencing en Sanger DNA-sequencing zijn twee methoden voor DNA-sequencing die behoren tot sequencing van de eerste generatie. De Maxam Gilbert-sequencingprocedure bepa alt de basensequentie door de 5'-uiteinde-gelabelde DNA-fragmenten chemisch te splitsen, bij voorkeur op elk van de vier nucleotiden en gelelektroforese. De Sanger-sequencingprocedure bepa alt de nucleotidesequentie door enkelstrengs DNA te synthetiseren met behulp van DNA-polymerase en dideoxynucleotiden en gelelektroforese. Dit is het belangrijkste verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing.
Wat is Maxam Gilbert Sequencing?
Maxam Gilbert-sequencing, ook wel chemische sequencing-methode genoemd, is een techniek die is ontwikkeld om de volgorde van de nucleotiden in DNA te bepalen. Deze methode werd in 1976 geïntroduceerd door W alter Gilbert en Alan Maxam en werd populair omdat het direct kan worden uitgevoerd met gezuiverd DNA. De Maxam Gilbert-methode behoort tot de eerste generatie van DNA-sequencing en het was de eerste sequencing-methode die op grote schaal door wetenschappers werd gebruikt.
Het basisprincipe van deze methode ligt in de beperking van de eindgelabelde DNA-fragmenten op specifieke basen door base-specifieke chemicaliën en omstandigheden en scheiding van de gelabelde fragmenten door elektroforese zoals weergegeven in figuur 01. Fragmenten worden gescheiden volgens hun maten op de gel. Omdat de fragmenten gelabeld zijn, kan de sequentie van het DNA-molecuul gemakkelijk worden afgeleid.
Maxam Gilbert-methode maakt gebruik van base-specifieke chemicaliën om DNA op specifieke basen te breken. Twee veel voorkomende chemicaliën genaamd dimethylsulfaat en hydrazine chemicaliën worden gebruikt om respectievelijk purines en pyrimidinen aan te vallen.
Maxam Gilbert-sequencing-methode wordt als volgt via verschillende stappen uitgevoerd.
- Zuivering van de DNA-sequentie met behulp van restrictie-endonucleasen
- Labeling van de uiteinden van de DNA-fragmenten door toevoeging van radioactieve fosfaten
- Zuivering van de gelabelde fragmenten van niet-gelabelde fragmenten door gelelektroforese
- Scheiding van het eindgelabelde DNA in vier buisjes en afzonderlijk behandelen met basespecifieke chemicaliën
- Elektroforese van de inhoud van elke buis op afzonderlijke lijnen op een gel en fragmentscheiding volgens hun lengte.
- Detectie van de fragmenten door autoradiografie.
Figuur 01: Maxam Gilbert-sequencing
Wat is Sanger-sequencing?
Sanger Sequencing is een sequentiemethode die in 1977 door Frederick Sanger en zijn collega's is ontwikkeld om de basensequentie van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Het is ook bekend als chain-termination sequencing of Dideoxy-sequencing-methode. Deze methode werkt volgens het principe van selectieve opname van ketenbeëindigende dideoxynucleotiden (ddNTP's) zoals ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP door DNA-polymerase tijdens de synthese van enkelstrengs DNA om strengvorming te beëindigen. Dideoxynucleotiden missen 3' OH-groepen voor de vorming van fosfodiesterbindingen met aangrenzend nucleotide. Daarom stopt de strengvorming zodra een ddNTP is opgenomen in de nieuw vormende streng tijdens sanger-sequencing.
Bij deze methode worden vier afzonderlijke DNA-synthesereacties (PCR) uitgevoerd in vier afzonderlijke buisjes met één type ddNTP. Er worden ook andere eisen gesteld aan de buisjes voor PCR, waaronder primers, dNTP's, Taq-polymerase, specifieke omstandigheden, enz. Vier afzonderlijke reacties worden uitgevoerd in vier buisjes met vier mengsels. Na PCR-reacties worden de resulterende DNA-fragmenten met warmte gedenatureerd en gescheiden door gelelektroforese. Vervolgens worden de fragmenten gevisualiseerd met behulp van een gelabelde (radioactieve of fluorescerende) primer of dNTP's zoals weergegeven in figuur 02.
Figuur 02: Sanger-reeksen
Wat is het verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| Maxam Gilbert-sequencing is de eerste techniek die is ontwikkeld voor DNA-sequencing. | Sanger-sequencing-methode werd geïntroduceerd na de Maxam Gilbert-sequencing-methode. |
| Gebruik | |
| Deze methode wordt zelden gebruikt. | Sanger-sequencing wordt routinematig gebruikt voor sequencing. |
| Gebruik van gevaarlijke chemicaliën | |
| Er worden gevaarlijke chemicaliën gebruikt. | Het gebruik van gevaarlijke chemicaliën is beperkt in vergelijking met de Maxam Gilbert-methode. |
| Etikettering voor detectie | |
| Deze methode maakt gebruik van radioactief P32 voor het labelen van de uiteinden van de DNA-fragmenten. | Sanger-sequencing maakt gebruik van radioactief of fluorescent gelabelde ddNTP's. |
Samenvatting – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert en Sanger-sequencing zijn twee soorten DNA-sequencingtechnieken die vallen onder de eerste generatie DNA-sequencing. Maxam Gilbert-sequencing is de eerste methode die in 1976 voor DNA-sequencing werd geïntroduceerd en wordt uitgevoerd door de eindgelabelde DNA-fragmenten te breken door base-specifieke chemicaliën. Daarom staat het bekend als chemische sequencing. De Sanger-sequencingmethode werd in 1977 geïntroduceerd en is gebaseerd op de door ddNTP aangedreven kettingbeëindigingsreacties. Sanger-sequencingmethode populairder dan Maxam Gilbert-methode vanwege verschillende nadelen van Maxam Gilbert-methode, zoals buitensporig tijdverbruik, gebruik van gevaarlijke chemicaliën, enz. Dit is het verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger-sequencing.
