Belangrijk verschil – PCR versus DNA-replicatie
DNA-replicatie is een natuurlijk proces dat plaatsvindt in levende organismen. Het omvat de productie van twee identieke kopieën van één DNA-molecuul. DNA-replicatie is een uiterst belangrijk proces van biologische overerving. Genetische informatie wordt van ouder op nageslacht doorgegeven, voornamelijk vanwege het vermogen tot DNA-replicatie. Daarom is het een essentieel proces dat in bijna alle levende organismen voorkomt. Dit proces vindt in vivo plaats. DNA-replicatie kan echter ook via in vitro methoden worden uitgevoerd. Polymerase Chain Reaction (PCR) is zo'n in vitro methode voor DNA-replicatie. PCR is een DNA-amplificatiemethode die in laboratoria wordt uitgevoerd. Het produceert duizenden tot miljoenen kopieën van DNA van een geïnteresseerd DNA-fragment of een gen. Er zijn verschillen tussen in vivo DNA-replicatie en PCR. Het belangrijkste verschil tussen deze twee is dat PCR wordt uitgevoerd in een PCR-machine bij gehandhaafde temperaturen om een groot aantal kopieën van DNA te produceren, terwijl DNA-replicatie in het lichaam plaatsvindt bij lichaamstemperatuur om twee identieke kopieën van een enkel DNA-molecuul te produceren.
Wat is PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een in vitro DNA-amplificatietechniek die routinematig wordt uitgevoerd in moleculaire biologische laboratoria. Deze methode maakte de productie mogelijk van duizenden tot miljoenen kopieën van een bijzonder geïnteresseerd DNA-fragment. PCR werd in 1980 geïntroduceerd door Kary Mullis. Bij deze techniek wordt het geïnteresseerde DNA-fragment als sjabloon gebruikt voor het maken van kopieën. Het enzym Taq-polymerase wordt gebruikt als het DNA-polymerase-enzym en het zal de synthese van nieuwe strengen van het DNA-fragment katalyseren. Primers die in het PCR-mengsel zitten, zullen werken als uitgangspunten voor de fragmentextensies. Aan het einde van de PCR-reactie kunnen veel kopieën van het DNA-monster worden verkregen.
Alle ingrediënten die nodig zijn om kopieën van DNA te maken, zitten in het PCR-mengsel. Het zijn monster-DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primers (voorwaartse en achterwaartse primers), nucleotiden (bouwstenen van DNA) en een buffer. PCR-reactie wordt uitgevoerd in een PCR-machine en deze moet worden gevoed met het juiste PCR-mengsel en het juiste PCR-programma. Als het reactiemengsel en het programma correct zijn, zal het de vereiste hoeveelheid kopieën van een bepaald stukje DNA produceren uit een zeer kleine hoeveelheid DNA.
Er zijn drie belangrijke stappen betrokken bij een PCR-reactie, namelijk denaturatie, primer-annealing en strengverlenging. Deze drie stappen vinden plaats bij drie verschillende temperaturen. DNA bestaat als een dubbelstrengs helix. Twee strengen zijn gebonden door waterstofbruggen. Voorafgaand aan amplificatie wordt dubbelstrengs DNA gescheiden door een hoge temperatuur te geven. Bij hoge temperatuur wordt dubbelstrengs DNA gedenatureerd tot enkelstrengs. Vervolgens hybridiseren de primers met de flankerende uiteinden van het geïnteresseerde fragment of het gen van het DNA. Primer is een kort stukje enkelstrengs DNA dat complementair is aan de uiteinden van de doelsequentie. Voorwaartse en achterwaartse primers hybridiseren met de complementaire basen aan de flankerende uiteinden van het gedenatureerde DNA-monster bij de annealingstemperatuur.
Wanneer primers worden geanneald met DNA, initieert het Taq-polymerase-enzym de synthese van de nieuwe strengen door nucleotiden toe te voegen die complementair zijn aan het template-DNA. Taq-polymerase is een hittebestendig enzym dat wordt geïsoleerd uit een thermofiele bacterie genaamd Thermus aquaticus. PCR-buffer handhaaft de optimale omstandigheden voor de Taq-polymerase-actie. Deze drie stadia van de PCR-reactie worden herhaald om de vereiste hoeveelheid van het PCR-product te produceren. Bij elke PCR-reactie verdubbelt het aantal DNA-kopieën. Daarom kan een exponentiële amplificatie worden waargenomen in PCR. PCR-product kan worden waargenomen met behulp van gelelektroforese omdat het de zichtbare hoeveelheid DNA op een gel produceert en het kan worden gezuiverd voor verder onderzoek zoals sequencing enz.
Figuur 01: PCR
PCR is een waardevol hulpmiddel in medisch en biologisch onderzoek. Vooral in forensische studies heeft PCR een enorme waarde, omdat het DNA kan versterken voor studies van de kleine monsters van de criminelen en forensische DNA-profielen kan maken. PCR wordt veel gebruikt in veel gebieden van de moleculaire biologie, waaronder genotypering, genklonering, mutatiedetectie, DNA-sequencing, DNA-microarrays en vaderschapstesten enz.
Wat is DNA-replicatie?
DNA-replicatie verwijst naar het proces dat twee identieke kopieën van DNA van één DNA-molecuul produceert. Het is een belangrijk proces van biologische overerving. DNA-replicatie komt voor in alle levende organismen. Het genoom van de oudercel moet worden gerepliceerd om het genoom over te dragen aan de dochtercel. Het DNA-replicatieproces heeft drie hoofdstappen die initiatie, verlenging en beëindiging worden genoemd. Deze stappen worden gekatalyseerd door verschillende enzymen. DNA-replicatie begint vanaf de locatie die de oorsprong van replicatie wordt genoemd in het genoom van de cellen. In het genoom bestaat DNA in dubbelstrengs vorm. Deze twee strengen worden gescheiden aan het begin van de DNA-replicatie en dit wordt gedaan door ATP-afhankelijke DNA-helicase. Het afwikkelen van DNA is de belangrijkste gebeurtenis die plaatsvindt in de initiatiestap. Door gescheiden DNA-strengen als sjablonen te gebruiken, synthetiseert DNA-polymerase de nieuwe complementaire strengen van de sjabloonstrengen in de 5'- naar 3'-richting. Dit is de stap die verlenging wordt genoemd. Beëindiging vindt plaats wanneer de twee replicatievorken elkaar ontmoeten aan het andere uiteinde van het ouderlijke chromosoom.
Figuur 02: DNA-replicatie
Behalve DNA-polymerase zijn verschillende enzymen zoals DNA-primase, DNA-helicase, DNA-ligase en topoisomerase betrokken bij de DNA-replicatie. Een speciaal kenmerk van de in vivo DNA-replicatie is dat het Okazaki-fragmenten produceert. Eén streng wordt continu gevormd terwijl de andere in kleine stukjes wordt gevormd.
Wat zijn de overeenkomsten tussen PCR en DNA-replicatie?
- Bij zowel PCR als DNA-replicatie wordt dubbelstrengs DNA van elkaar gescheiden.
- In zowel PCR- als DNA-replicatieprocessen wordt DNA gekopieerd.
- Zowel PCR- als DNA-replicatieprocessen zijn erg belangrijk.
- Bij zowel PCR- als DNA-replicatieprocessen is het DNA-polymerase-enzym betrokken.
Wat is het verschil tussen PCR en DNA-replicatie?
PCR versus DNA-replicatie |
|
| PCR is een in vitro methode voor DNA-amplificatie waarbij duizenden tot miljoenen kopieën van DNA worden geproduceerd. | DNA-replicatie is een natuurlijk proces dat twee identieke kopieën van DNA van één DNA-molecuul produceert. |
| Stappen | |
| PCR heeft drie stappen; denaturatie, primer annealing en strengverlenging. | DNA-replicatie heeft drie stappen; initiatie, verlenging en beëindiging. |
| Betrokkenheid van primers | |
| PCR heeft kunstmatige primers nodig. | DNA-replicatie heeft geen kunstmatige primers nodig. Een kort fragment van RNA is betrokken bij DNA-replicatie. |
| Denaturatie van de dubbele strengen | |
| Dubbele strengen worden gescheiden door een hoge temperatuur in PCR toe te passen. | Dubbele strengen worden van elkaar gescheiden door het enzym DNA-helicase in DNA-replicatie. |
| Enzymbetrokken | |
| PCR gebruikt Taq-polymerase. | DNA-replicatie maakt gebruik van DNA-polymerase. |
| Temperatuur | |
| PCR vindt plaats bij drie verschillende temperaturen in een machine. | DNA-replicatie vindt plaats bij lichaamstemperatuur in het lichaam van het levende organisme. |
| In vivo of In vitro | |
| PCR is een in vitro methode. | DNA-replicatie is een in vivo methode. |
Samenvatting – PCR versus DNA-replicatie
DNA-replicatie is een proces waarbij twee identieke kopieën van DNA worden geproduceerd uit een enkel DNA-molecuul. Het komt voor in alle levende organismen, omdat het een methode biedt om de genetische informatie van ouder aan nakomelingen te geven. Het bestaat uit drie enzymatisch gekatalyseerde stappen, namelijk initiatie, verlenging en beëindiging. DNA-replicatie kan kunstmatig in het laboratorium worden gedaan. PCR is een manier om een groot aantal kopieën van DNA te produceren van het geïnteresseerde DNA. PCR wordt routinematig uitgevoerd in moleculair biologische laboratoria, omdat het een gemakkelijke methode is om kopieën van DNA te produceren. Dit is het verschil tussen PCR en DNA-replicatie.
