Belangrijk verschil – PCR versus DNA-sequencing
PCR en DNA-sequencing zijn twee belangrijke technieken in de moleculaire biologie. Polymerase Chain Reaction (PCR) is het proces waarbij een groot aantal kopieën van een DNA-fragment wordt gemaakt. DNA-sequencing is de techniek die resulteert in de precieze volgorde van de nucleotiden van een bepaald DNA-fragment. Dit is het belangrijkste verschil tussen PCR en DNA-sequencing. PCR is een van de belangrijkste stappen bij DNA-sequencing.
Wat is PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een DNA-amplificatietechniek die wordt gebruikt in de moleculaire biologie. Het produceert duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment. Deze methode is in 1983 door Kary Mullis ontwikkeld. Bij deze techniek dient het DNA-fragment dat moet worden geamplificeerd als de matrijs en het DNA-polymerase-enzym voegt complementaire nucleotiden toe aan de primer die beschikbaar is in het PCR-mengsel. Aan het einde van de PCR-reactie worden veel kopieën van het DNA-monster gesynthetiseerd.
Er zijn verschillende componenten van het PCR-mengsel, waaronder DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primers (voorwaartse en achterwaartse primers), nucleotiden (bouwstenen van DNA) en een buffer. PCR vindt plaats in een PCR-machine en het juiste PCR-mengsel moet in de machine worden geladen en het juiste programma moet worden aangestuurd. Deze techniek maakt de productie mogelijk van duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald stukje DNA uit een zeer kleine hoeveelheid DNA.
PCR-reacties vinden plaats op een cyclische manier om de zichtbare hoeveelheid PCR-producten op een gel te produceren. Er zijn drie belangrijke stappen betrokken bij een PCR-reactie, namelijk denaturatie, primer-annealing en strengverlenging, zoals weergegeven in figuur 01. Deze drie stappen vinden plaats bij drie verschillende temperaturen. DNA bestaat in dubbelstrengs vorm door waterstofbruggen tussen de complementaire basen. Voorafgaand aan implicatie moet dubbelstrengs DNA van elkaar worden gescheiden. Het wordt gedaan door een hoge temperatuur te geven. Bij hoge temperatuur denatureert dubbelstrengs DNA in enkelstrengs. Dan moeten de primers dichter bij de flankerende uiteinden van het specifieke fragment of het gen van het DNA komen. Primer is een kort stukje enkelstrengs DNA dat complementair is aan de doelsequentie. Voorwaartse en achterwaartse primers hybridiseren met de complementaire basen aan de flankerende uiteinden van het gedenatureerde DNA-monster bij de annealingstemperatuur. Primers moeten hittebestendig zijn. Zodra de primers versmelten met het DNA-monster, initieert het taq-polymerase-enzym de synthese van de nieuwe strengen door nucleotiden toe te voegen die complementair zijn aan het doel-DNA. Taq-polymerase is een hittebestendig enzym dat is geïsoleerd uit een thermofiele bacterie genaamd Thermus aquaticus. PCR-buffer handhaaft de optimale omstandigheden voor de werking van taq-polymerase. Deze drie stadia van PCR-reacties worden herhaald om de vereiste hoeveelheid PCR-product te produceren. Na elke PCR-reactie wordt het aantal DNA-kopieën verdubbeld. Daarom kan een exponentiële amplificatie worden waargenomen in PCR. PCR-producten kunnen worden waargenomen met behulp van gelelektroforese en kunnen worden gezuiverd voor verder onderzoek.
Figuur 01: Belangrijkste stappen van een PCR-reactie
PCR is een waardevol hulpmiddel in medisch en biologisch onderzoek. PCR heeft een speciale waarde in de forensische wetenschap, omdat het DNA kan versterken voor studies van de kleine monsters van de criminelen en forensische DNA-profielen kan maken. PCR wordt veel gebruikt in veel gebieden van de moleculaire biologie, waaronder genotypering, genklonering, mutatiedetectie, DNA-sequencing, DNA-microarrays en vaderschapstesten, enz.
Figuur 02: Polymerasekettingreactie
Wat is DNA-sequencing?
DNA-sequencing is de bepaling van een precieze volgorde van de nucleotiden - adenine, guanine, cytosine en thymine in een bepaald DNA-fragment. Genetische informatie wordt opgeslagen in de DNA-sequenties met behulp van de juiste volgorde van de nucleotiden. Het vinden van de precieze volgorde van de nucleotiden in een DNA-fragment is daarom erg belangrijk om te weten over de structuur en functie van de genen.
Het DNA-sequencingprotocol omvat verschillende processen. De eerste stap is de isolatie van geïnteresseerd DNA of genomisch DNA van een organisme. Met behulp van PCR (zoals hierboven beschreven), moet het gewenste gebied van het DNA worden geamplificeerd. Het geamplificeerde PCR-product moet worden gescheiden door gelelektroforese en worden gezuiverd. Geamplificeerde fragmenten dienen als templates voor sequencing. Sequentiebepaling kan worden uitgevoerd volgens de Sanger-sequencing- of high-throughput-sequencingmethode. Sanger-sequencing vereist capillaire elektroforese van resulterende DNA-fragmenten. Bepaling van de juiste nucleotidevolgorde kan worden gedaan door het handmatig uitlezen van autoradiogrammen of door gebruik te maken van geautomatiseerde DNA-sequencers.
Gene-sequencing droeg bij aan het menselijk genoomproject en faciliteerde het in kaart brengen van het menselijk genoom in 2003. In de forensische geneeskunde maakte DNA-sequencing de identificatie mogelijk van individuen die unieke DNA-sequenties vertonen en de criminelen identificeren. In de geneeskunde kan DNA-sequencing worden gebruikt om de genen die verantwoordelijk zijn voor genetische en andere ziekten te detecteren, defecte genen te vinden en deze te vervangen door de juiste genen. In de landbouw wordt DNA-sequentie-informatie van sommige micro-organismen gebruikt om transgene gewassen te produceren met economisch gewenste eigenschappen.
Figuur 03: DNA-sequencing
Wat is het verschil tussen PCR en DNA-sequencing?
PCR versus DNA-sequencing |
|
| PCR-proces creëert duizenden tot miljoenen kopieën van het geïnteresseerde DNA-fragment. | DNA-sequencing is het proces waarbij de precieze volgorde van de nucleotiden in een bepaald DNA-fragment wordt bepaald. |
| Resultaat | |
| PCR maakt duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment | Dit resulteert in de juiste volgorde van de basen in een bepaald DNA-fragment. |
| Betrokkenheid van ddNTP's | |
| PCR vereist geen ddNTP's. Het gebruikt dNTP's. | DNA-sequencing vereist ddNTP's om strengvorming te beëindigen. |
Samenvatting – PCR versus DNA-sequencing
PCR en DNA-sequencing zijn zeer belangrijke hulpmiddelen op veel gebieden van de moleculaire biologie. Amplificatie van de DNA-fragmenten wordt gedaan door de PCR-techniek, terwijl de juiste volgorde van de nucleotiden van een DNA-fragment wordt bepaald door de DNA-sequencing. Dit is het verschil tussen PCR en DNA-sequencing.
