Het belangrijkste verschil tussen willekeurige primers en oligo-dT is dat de willekeurige primer een mengsel is van alle mogelijke hexameer-oligonucleotidesequenties, terwijl de oligo-dT-primer bestaat uit een enkelstrengs stuk van 12-18 deoxythymidines.
Reverse transcriptie is een mechanisme waarin cDNA kan worden gesynthetiseerd met behulp van mRNA of elke soort RNA. Om cDNA te produceren, moeten reverse transcriptase-enzym en andere noodzakelijke componenten worden verschaft, in het bijzonder matrijs en primers. Primers zijn de korte DNA-sequenties die specifiek zijn ontworpen voor de amplificatie van de doelsequenties. Willekeurige primers en oligo-dT-primers zijn twee veelvoorkomende typen primers die worden gebruikt bij reverse transcriptie. Daarom zijn willekeurige primers of oligo-dT-primers korte DNA-oligonucleotidesequenties die nodig zijn voor reverse transcriptase om reverse transcriptie te initiëren. Afhankelijk van de RNA-template kan uit deze twee typen primers de geschikte primer worden gekozen.
Wat zijn willekeurige primers?
Random primer is een mengsel van oligonucleotiden die alle mogelijke hexameersequenties vertegenwoordigen. De primersequentie van willekeurige primer is 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T of C. Daarom kunnen willekeurige primers worden gebruikt voor de amplificatie van enkelstrengs DNA of RNA door DNA-polymerase of reverse transcriptase, respectievelijk. Bovendien is een willekeurig primermengsel in staat om alle gebieden van het RNA te amplificeren om cDNA te genereren. Het produceert dus verschillende lengtes cDNA.
Figuur 01: Willekeurige primers
Het belangrijkste is dat het willekeurige primermengsel geen sjabloonspecificiteit vertoont. Het is niet in staat om mRNA en andere RNA-soorten te onderscheiden. En het gloeit met elke soort RNA in het monster. Een willekeurig primermengsel is echter geschikt voor reverse transcriptie van RNA's zonder poly(A)-staarten, zoals rRNA, tRNA, niet-coderende RNA's, kleine RNA's, prokaryotisch mRNA enz., afgebroken RNA en RNA met bekende secundaire structuren.
Wat is Oligo dT?
Oligo dT-primer is een stuk 12 – 18 deoxythymine (dT). De primersequentie kan worden weergegeven als 5'-d (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3. Het wordt gebruikt voor de productie van cDNA uit mRNA dat poly(A)-staart bevat. Kortom, het werkt als een primer voor de reactie die wordt gekatalyseerd door reverse transcriptase. Tijdens de omgekeerde transcriptie anne alt de oligo-dT-primer met de poly-geadenyleerde staart aan het 3'-uiteinde van de meeste eukaryote mRNA's en start het proces.
Figuur 02: Omgekeerde transcriptie met Oligo dT Primer
In tegenstelling tot willekeurige primer is oligo-dT-primer niet geschikt voor afgebroken RNA of RNA zonder poly(A)-staarten, waaronder prokaryotisch RNA en microRNA.
Wat zijn de overeenkomsten tussen willekeurige primers en Oligo dT?
- Random-primer en oligo-dT-primer zijn twee soorten primers die worden gebruikt bij reverse transcriptie en het maken van cDNA.
- Het samen gebruiken van de willekeurige primer en oligo-dT-primer verhoogt de gevoeligheid van cDNA-synthese.
- Het zijn enkelstrengs korte nucleotidesequenties.
Wat is het verschil tussen willekeurige primers en Oligo dT?
Random-primer is een korte oligonucleotidesequentie die is samengesteld uit een willekeurige sequentie. Ondertussen is oligo-dT-primer een korte streng die bestaat uit 12 tot 18 deoxythymidines. Dit is dus het belangrijkste verschil tussen willekeurige primers en oligo-dT. De volgorde van de willekeurige primer is 5´ – d (NNNNNN) –3´ N=G, A, T of C. Terwijl de volgorde van de oligo-dT-primer 5´-d is (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)-3´. Daarom kunnen we dit beschouwen als een ander verschil tussen willekeurige primers en oligo-dT.
Bovendien vertonen willekeurige primers geen matrijsspecificiteit en hybridiseren ze met elke soort RNA, terwijl oligo-dT-primers specificiteit vertonen voor poly(A)-staarten van eukaryotisch mRNA.
De onderstaande infographic vat het verschil samen tussen willekeurige primers en oligo-dT.
Samenvatting – Willekeurige primers vs Oligo dT
Random-primer en oligo-dT-primer zijn twee soorten primers die worden gebruikt bij cDNA-synthese. Willekeurige primer bestaat uit een mengsel van oligonucleotiden, die alle mogelijke hexameersequenties vertegenwoordigen, terwijl oligo-dT-primer een enkelstrengige sequentie van 12 tot 18 deoxythymidines is. Dit is dus het belangrijkste verschil tussen willekeurige primers en oligo-dT. Bovendien zijn oligo-dT-primers nuttig voor reverse transcriptie van RNA van volledige lengte met poly(A)-staart, terwijl willekeurige primers nuttig zijn voor reverse transcriptie van de meeste RNA-soorten, inclusief afgebroken RNA, RNA zonder poly(A)-staarten en RNA-bevattende secundaire structuren. Daarom vertoont de willekeurige primer geen matrijsspecificiteit, terwijl oligo-dT-primer specificiteit vertoont voor eukaryotisch mRNA dat poly(A)-staart bevat.
