Belangrijk verschil - PCR-primers versus sequencing-primers
Met de recente ontwikkelingen op het gebied van moleculaire biologie, werden verschillende genetische technieken ontwikkeld die de onderzoeksprocessen van verschillende richtingen van het onderwerp gemakkelijk en nauwkeurig maakten. PCR en andere sequentiebepalingsprocedures zijn twee belangrijke van dergelijke technieken. Ze gebruiken verschillende subcomponenten. Primers worden beschouwd als de belangrijkste subcomponent die gemeenschappelijk is voor zowel PCR- als Sequencing-technieken. PCR-primers worden gebruikt voor amplificatie van een bepaalde DNA-sequentie, terwijl sequencing-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke volgorde van de nucleotidesequentie te onthullen. Dit is het belangrijkste verschil tussen PCR-primers en sequencing-primers.
Wat zijn PCR-primers?
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een genetische techniek die in de moleculaire biologie wordt gebruikt om een enkele of enkele kopieën van een bepaald DNA-segment te versterken en vele miljoenen identieke kopieën te verkrijgen. In een PCR-reactie worden verschillende componenten gebruikt, waaronder primers. Primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidelengte van 18-25 waardoor ze compatibel zijn met het begin- en het eindgebied van de te amplificeren DNA-fragmenten. Primers kunnen een forward primer en reverse primer zijn. Deze primers binden aan het DNA-fragment op de specifieke punten waar het DNA-polymerase doet binden aan de specifieke primer op de locatie en de synthese van de nieuwe DNA-streng initiëren.
De selectie van primers is een belangrijk aspect van het PCR-proces. De keuze van de lengte van de primer is belangrijk. De ideale lengte zou 18-25 nucleotiden zijn. Als de lengte te kort of te lang is, zullen de primers niet binden aan de DNA-sequentie die nauwkeurig moet worden geamplificeerd. Primers met een te korte lengte leiden tot niet-specifieke annealing van de primer op verschillende locaties van de DNA-sequentie.
Figuur 01: PCR-primers
Het geh alte aan guanine en cytosine (GC) in een goede primer moet tussen 40-60 liggen. De gloeitemperatuur van de primer en de smelttemperatuur zijn essentiële factoren tijdens PCR. De smelttemperatuur moet nauwkeurig worden berekend en de onthardingstemperatuur van de primer moet 5 0C lager zijn dan de smelttemperatuur. De smelttemperatuur moet 60 °C en 75 °C zijn. Te hoge of te lage temperaturen zullen resulteren in minder actieve DNA-polymerase-activiteit.
Wat zijn sequencing-primers?
Sequencing-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen. Om goede sequentieresultaten te verkrijgen, zijn primers en sjablonen van hoge kwaliteit belangrijk. Wanneer primers worden geselecteerd, moeten ze dus uniek zijn voor een bepaald gebied waar we de sequentie willen bepalen. Het moet ook met een juiste oriëntatie zijn waarbij de sequenties meestal worden gegenereerd van 3 'naar 5'-uiteinden van de primers. De sequentie zou ongewenste zelfhybridisatie moeten missen, zoals de vorming van haarspeldlussen. Het mag geen opeenvolgende vorming van Guanine-basen bevatten.
De smelttemperatuur (Tm) van de primer moet geschikt zijn voor de omstandigheden van de sequencing. Daarom moet het tussen 52oC en 74oC liggen. Bereiding van oligonucleotiden die als primer gebruikt moeten worden, moet worden gezuiverd om de gewenste volledige lengte van de sequentie te verkrijgen. Als de oligonucleotiden onzuiverheden bevatten, zal de signalering van de primersequentie worden gesuperponeerd vanaf verschillende priming-plaatsen, en het zal ook het aantal basecellen verminderen.
Figuur 02: Primers op volgorde zetten
De smelttemperatuur van de primer (Tm) van een oligonucleotide bepa alt hoe sterk de complementaire DNA-strengen met elkaar worden gehybridiseerd. Tm kan worden beschouwd als een thermodynamische berekening waarbij het afhankelijk is van zowel DNA-sequenties als verschillende omstandigheden zoals zoutconcentratie. De Tm is belangrijk tijdens PCR, waarbij een variant, de cycle sequencing genaamd, wordt gebruikt om een groep van dideoxynucleotide-getermineerde fragmenten te produceren. Hier zal de primer waarvan de sequentie wordt bepaald aanvankelijk alternatief worden geanneald, vervolgens worden verlengd en tenslotte worden gedenatureerd voor amplificatie. Daarom moet de Tm-waarde tussen 52oC en 74o C liggen. Gesynthetiseerde oligonucleotiden kunnen worden verkregen bij DNA/RNA-syntheselaboratoria volgens keuze. De kleinschalige synthese die wordt gebruikt voor DNA-sequencing is meestal 50 nmol. Het belangrijkste is ook dat de primers die voor sequencing worden gebruikt, moeten worden gezuiverd om vrij te zijn van onzuiverheden die de kwaliteitsvermindering zullen voorkomen.
Wat zijn de overeenkomsten tussen PCR-primers en sequencing-primers?
- Zowel PCR-primers als Sequencing-primers zijn primers die worden gebruikt in het amplificatieproces van een gerichte DNA-sequentie.
- Zowel PCR-primers als Sequencing-primers zijn samengesteld uit nucleotiden.
- Zowel PCR-primers als Sequencing-primers zijn korte oligomeren.
Wat is het verschil tussen PCR-primers en sequencing-primers?
PCR-primers versus sequencing-primers |
|
| PCR-primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidesequentielengte van 18-25 waardoor ze compatibel zijn met het begin- en het eindgebied van de DNA-fragmenten die moeten worden geamplificeerd. | Sequencing-primers zijn korte oligomeren die worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen. |
| Functie | |
| PCR-primers worden gebruikt voor amplificatie van een bepaalde DNA-sequentie. | Sequencing-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen. |
| Aantal primers nodig | |
| Twee primers; een forward primer en een reverse primer worden gebruikt als PCR-primers. | Slechts één primer nodig als sequencing-primer. |
Samenvatting – PCR-primers versus sequencing-primers
Sequencing-primers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen. Eén sequencing-primer is voldoende om het proces uit te voeren. Om goede sequentieresultaten te verkrijgen, zijn primers en sjablonen van hoge kwaliteit belangrijk. Wanneer primers worden geselecteerd, moeten ze dus uniek zijn voor een bepaald gebied waar we de sequentie willen bepalen. PCR-primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidelengte van 18-25 die compatibel is met het begin- en het eindgebied van de DNA-fragmenten die moeten worden geamplificeerd. PCR-primers kunnen een forward primer en reverse primer zijn. Het geh alte aan guanine en cytosine (GC) in een goede primer moet tussen de 40-60 liggen. De gloeitemperatuur en smelttemperatuur van de primer zijn essentiële aspecten tijdens PCR. Dit is het verschil tussen PCR-primers en Sequencing-primers.
