Belangrijk verschil - cDNA versus genomische bibliotheek
Er zijn twee hoofdtypen DNA-bibliotheken die door wetenschappers zijn geconstrueerd met behulp van genetische manipulatietechnieken. Dat zijn cDNA-bibliotheek en Genomic-bibliotheek. Het belangrijkste verschil tussen cDNA en genomische bibliotheek is dat cDNA-bibliotheek het gekloneerde complementaire DNA van totaal mRNA van een organisme bevat, terwijl de genomische DNA-bibliotheek de gekloonde fragmenten van het gehele genoom van een organisme bevat. De genomische DNA-bibliotheek is groter dan de cDNA-bibliotheek.
Wat is een genomische bibliotheek?
Een genomische DNA-bibliotheek is een verzameling klonen die de fragmenten van het totale genomische DNA van een organisme dragen. Het bevat het volledige genomische DNA van dat organisme, inclusief coderende en niet-coderende sequenties. De constructie van een genomische bibliotheek wordt uitgevoerd door de recombinant-DNA-technologie gevolgd door klonering (genetische manipulatie). Er zijn verschillende stappen betrokken bij de constructie, zoals weergegeven in figuur 01. Het proces begint met de isolatie van genomisch DNA. Met behulp van een geschikt DNA-extractieprotocol moet het totale genomische DNA van een organisme worden geïsoleerd. Vervolgens moet het DNA door restrictie-endonucleasen (DNA-cutting enzymen) worden omgezet in hanteerbare maten of in de specifieke fragmenten. Gefragmenteerd DNA moet in vectoren worden ingevoegd met behulp van DNA-ligasen (DNA-bindende enzymen). Een vector is een zelfreplicerend organisme. Plasmiden en bacteriofagen zijn veelgebruikte vectoren in de recombinant-DNA-technologie. Deze geligeerde vectoren staan bekend als recombinante DNA-moleculen omdat ze zowel eigen als ingevoegde DNA-sequenties dragen. Recombinante vectoren worden toegevoegd aan een gastheerbacterie en gemaakt om de recombinante vectoren in de bacteriële cel op te nemen. Bacteriën met recombinante vectoren (plasmiden) moeten in een kweekmedium worden gekweekt. Tijdens de bacteriële vermenigvuldiging repliceert bacterieel DNA, samen met recombinante plasmiden, hun genomen en produceert klonen. Deze klonen bevatten het volledige genoom van het bronorganisme. Daarom wordt het een genomische bibliotheek genoemd. Plasmiden kunnen gemakkelijk worden gescheiden van het bacteriële chromosomale DNA om de genomische bibliotheek van dat organisme te construeren. Als een bepaald organisme geïnteresseerde genen bevat, is het gemakkelijk te detecteren in de genomische bibliotheek door hybridisatie met behulp van moleculaire probes (markers).
Genomische bibliotheken zijn belangrijk om de genomische structuur en functie, specifieke genen, genlocatie, genmapping, mutaties, gensequencing, identificatie van nieuwe therapeutische genen enz. te bestuderen.
Figuur_1: Bouw van een genomische bibliotheek
Wat is een cDNA-bibliotheek?
Een cDNA-bibliotheek is een verzameling complementaire DNA-klonen (cDNA) die zijn gesynthetiseerd uit totaal mRNA van een organisme. De bouwprocedure omvat verschillende stappen. Zuivering van totaal mRNA uit een organisme is de eerste betrokken stap. Geïsoleerd mRNA wordt omgezet in cDNA-strengen door een proces dat reverse transcriptie wordt genoemd. Reverse transcriptie wordt mogelijk gemaakt door een enzym dat reverse transcriptase wordt genoemd. Het maakt gebruik van een kleine 3'-primer en initieert de synthese van de eerste cDNA-streng die complementair is aan de mRNA-streng van de matrijs. Resulterend dubbelstrengs cDNA wordt omgezet in kleinere fragmenten met behulp van restrictie-endonucleasen en ingebracht in geschikte vectoren. Deze geconstrueerde recombinante moleculen worden vervolgens toegevoegd aan een gastheerorganisme en gekweekt in een kweekmedium om klonen te produceren. De verzameling klonen die cDNA-fragmenten van een organisme bevat, staat bekend als een cDNA-bibliotheek. Volledig gesneden rijp mRNA bevat geen introns en regulerende regio's. Daarom zijn niet-coderende fragmenten niet aanwezig in cDNA-bibliotheken, in tegenstelling tot een genomische bibliotheek.
cDNA-bibliotheken zijn belangrijk voor de analyse van coderende regio's, genfuncties, expressie van genen enz.
Figuur_2: Constructie van een cDNA-bibliotheek
Wat is het verschil tussen cDNA en Genomic Library?
cDNA versus genomische bibliotheek |
|
| cDNA-bibliotheek is een verzameling van klonen die het complementaire DNA van het mRNA van een organisme dragen | Genomische bibliotheek is een verzameling van de klonen die het totale genomische DNA van een organisme dragen. |
| Coding vs niet-coderende sequenties | |
| cDNA-bibliotheek bevat alleen de coderende sequenties; het bevat geen introns. | Genomische bibliotheek bestaat uit het gehele genomische DNA inclusief niet-coderend (introns en regulerend) DNA. |
| Maat | |
| cDNA-bibliotheek is klein. | Genomische bibliotheek is groot. |
| Startmateriaal | |
| Uitgangsmateriaal is mRNA | Het uitgangsmateriaal is DNA. |
| Betrokkenheid van omgekeerde transcriptie. | |
| Reverse transcriptie vindt plaats in de synthese van de eerste cDNA-streng. | Reverse transcriptie gebeurt niet. |
Samenvatting – cDNA en genomische bibliotheek
De genomische bibliotheek vertegenwoordigt een populatie van klonen die het gefragmenteerde totale genomische DNA van een organisme dragen. cDNA-bibliotheek vertegenwoordigt de populatie van klonen die complementair DNA van het totale mRNA van een organisme dragen. Een cDNA-kloon bevat alleen de sequenties die in mRNA worden gevonden, terwijl de genomische kloon de sequenties van het gehele genoom bevat. Dit is het verschil tussen cDNA en genomische bibliotheek.
