Belangrijk verschil – Genklonen versus PCR
De synthese van vele kopieën van DNA van een specifiek DNA-fragment wordt DNA-amplificatie genoemd. Er zijn twee belangrijke DNA-amplificatieprocessen, namelijk genklonering en PCR. Het belangrijkste verschil tussen genklonen en PCR is dat genklonen de meerdere kopieën van een specifiek gen in vivo produceert door een recombinant DNA te construeren en in een gastheerbacterie te groeien, terwijl PCR miljoenen kopieën van een specifiek DNA-fragment in vitro produceert dat herhaalde cycli van denaturatie en synthese.
Wat is het klonen van genen?
Genklonen is een techniek die wordt gebruikt om een specifiek gen te lokaliseren en te vermenigvuldigen uit het geëxtraheerde genomische DNA van een organisme door middel van de constructie van recombinant DNA. Genomisch DNA bevat duizenden verschillende genen die worden gecodeerd voor eiwitten. Wanneer DNA wordt geëxtraheerd, bevat het alle mogelijke genen die het kan dragen. De genkloneringstechniek heeft de detectie van een specifiek gen uit het totale DNA mogelijk gemaakt. Daarom is het klonen van genen een belangrijk hulpmiddel in de moleculaire biologie.
Het maken van een genomische bibliotheek van een organisme is essentieel bij het klonen van genen als er geen idee is over de locatie van het relevante gen in het DNA. Een genomische bibliotheek wordt gemaakt met behulp van de volgende stappen.
Stap 1: Extractie van het totale DNA van een organisme dat het gewenste gen bevat.
Stap 2: Restrictiedigestie van het geëxtraheerde DNA om kleine hanteerbare fragmenten te produceren. Deze stap wordt vergemakkelijkt door restrictie-endonucleasen.
Stap 3: Selectie van een geschikte vector en openen van het vector-DNA met dezelfde restrictie-endonucleasen. Bacteriële plasmiden worden vaak gebruikt als vectoren om vreemd DNA te dragen. Plasmiden zijn kleine cirkels van DNA die zich in bacteriën bevinden.
Stap 4: Combinatie van het vector-DNA en gefragmenteerd DNA om een recombinant DNA-molecuul te produceren. Deze stap wordt bepaald door DNA-ligase.
Stap 5: Overdracht van recombinante DNA-moleculen naar gastheerbacteriën. Deze stap staat bekend als transformatie en wordt gedaan met behulp van een hitteschok.
Stap 5: Screening van getransformeerde bacteriële cellen op een kweekmedium. Aan het einde van het transformatieproces wordt een gemengde populatie van getransformeerde en niet-getransformeerde gastheercellen verkregen. Als gen van belang omvat alleen in getransformeerde gastheercellen. Daarom is het noodzakelijk om getransformeerde cellen te selecteren. De selectie gebeurt met behulp van selectieve media die antibiotica bevatten. Alleen de getransformeerde cellen groeien op dit screeningsmedium waardoor de selectie mogelijk is.
Stap 6: Het kweken van bacteriën om een genenbibliotheek te produceren. In deze stap worden de getransformeerde gastheercellen geïntroduceerd in verse kweekmedia die optimale groei-eisen verschaffen. Totale kolonies op de kweekplaten vertegenwoordigen de genomische bibliotheek van dat organisme.
Stap 7: Het recombinante DNA-molecuul dat het gen van belang bevat, moet worden gescreend uit duizenden gekloonde fragmenten van recombinant DNA. Het kan worden bereikt door het gebruik van sondes die het specifieke gen markeren of de specifieke eiwitresultaten van dat gen.
Zodra het geïnteresseerde gen dat de bacteriekolonie bevat is geïdentificeerd uit de totale kolonies, is het mogelijk om miljoenen kopieën te maken van het recombinante plasmide dat het gen bevat.
Gene cloning wordt gebruikt bij het opzetten van genenbibliotheken, het produceren van speciale eiwitten, vitamines, antibiotica, hormonen, het bepalen en in kaart brengen van genomen van de organismen, het maken van meerdere kopieën van het DNA van individuen in forensisch onderzoek enz.
Figuur_1: Genklonen
Wat is PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek die een groot aantal kopieën van een bepaald DNA-fragment genereert. Exponentiële amplificatie van een specifieke DNA-sequentie wordt verkregen door PCR onder in vitro omstandigheden. Deze techniek is een zeer krachtig hulpmiddel in de moleculaire biologie, omdat het een klein stukje DNA kan vermenigvuldigen tot een bruikbare hoeveelheid. PCR werd in 1983 geïntroduceerd door Kary Mullis en deze prijswinnende uitvinding zorgde voor een enorme vooruitgang in de moleculaire biologie.
PCR-techniek volgt herhaalde PCR-reacties zoals weergegeven in figuur 02. Eén PCR-reactie bestaat uit drie hoofdstappen die plaatsvinden bij drie verschillende temperaturen; denaturering van dubbelstrengs DNA bij 94 0C, annealing van primers bij 68 0C en strengverlenging bij 72 0 C. Daarom, wanneer PCR wordt uitgevoerd, moeten temperatuurschommelingen sterk worden gehandhaafd voor een goede replicatie. PCR wordt uitgevoerd in een PCR-machine in PCR-buizen. PCR-buisjes zijn geladen met correcte PCR-mengsels die matrijs-DNA, Taq-polymerase, primers, dNTP's en buffer bevatten. Denaturering van dubbelstrengs monster-DNA in enkelstrengs DNA wordt gedaan door de waterstofbruggen tussen complementaire basen te verbreken bij 94 – 98 0C. Vervolgens worden enkele strengen matrijs-DNA blootgelegd voor primers. Er moet een paar primers (vooruit en achteruit) worden geleverd en deze moeten thermostabiel zijn om hoge temperaturen te verdragen. Primers zijn enkelstrengs korte DNA-sequenties die complementair zijn aan de uiteinden van het doel-DNA-fragment. Bij PCR worden synthetische primers gebruikt. Primers binden met de complementaire basen van monster-DNA en initiëren de synthese van een nieuwe streng. Deze stap wordt gekatalyseerd door een enzym genaamd Taq-polymerase; een thermostabiel DNA-polymerase-enzym geïsoleerd uit Thermus auqaticus. Wanneer primers en nucleotiden (bouwstenen) beschikbaar zijn, construeert Taq-polymerase de nieuwe DNA-streng die complementair is aan template-DNA. Aan het einde van het PCR-programma wordt geamplificeerd DNA-fragment waargenomen met behulp van gelelektroforese. Indien verdere analyse nodig is, wordt het PCR-product uit de gel gezuiverd.
PCR is erg handig voor het diagnosticeren en monitoren van genetische en verworven ziekten, identificatie van criminelen (op het gebied van forensisch onderzoek), het bestuderen van de structuur en functie van een gericht DNA-segment, sequencing en het in kaart brengen van genomen van organismen, enz. PCR is een routinematige laboratoriumtechniek geworden in onderzoekslaboratoria voor medische en moleculaire biologie onder wetenschappers, omdat het een breed scala aan toepassingen heeft.
Figuur_2: Polymerasekettingreactie
Wat is het verschil tussen genklonering en PCR?
Gene Cloning vs PCR |
|
| Genklonen is het proces waarbij in vivo meerdere kopieën van een specifiek gen worden gemaakt door middel van recombinant DNA en wordt getransformeerd in een gastheerbacterie. | De PCR-techniek produceert in vitro meerdere kopieën van een bepaalde DNA-sequentie door herhaalde cycli van PCR-reacties. |
| Vereiste voor het construeren van recombinant DNA | |
| Recombinant DNA wordt geproduceerd om het gen te lokaliseren. | Recombinant DNA wordt niet geproduceerd. |
| Behoefte aan arbeid | |
| Dit proces is arbeidsintensief. | Intensieve arbeid is niet nodig. |
| In vivo of in vitro proces | |
| De constructie van recombinant DNA is in vitro en de amplificatie van DNA is in vivo. | De amplificatie van DNA gebeurt volledig in vitro. |
Samenvatting – Genklonen versus PCR
Gene-klonering en PCR zijn twee methoden die worden gebruikt voor DNA-amplificatie. PCR is een in vitro proces waarbij meerdere kopieën van DNA van een bepaald DNA-fragment worden gemaakt zonder gebruik te maken van recombinant DNA en een gastheerorganisme. Het klonen van genen is in de eerste plaats een in vivo proces dat resulteert in meerdere kopieën van een geïnteresseerd gen in het gastheerorganisme via de constructie van recombinant DNA. Dit is het verschil tussen het klonen van genen en PCR.
