Het belangrijkste verschil tussen conventionele geneste en real-time PCR-assays is dat conventionele PCR een techniek is die is ontwikkeld om specifieke DNA-sequenties te amplificeren en dat geneste PCR een modificatie is van conventionele PCR die bestaat uit twee opeenvolgende amplificatiereacties, terwijl echte -time PCR is een variant van conventionele PCR die het geamplificeerde product kan kwantificeren.
PCR is een veel voorkomende wetenschappelijke techniek die veel wordt gebruikt in onderzoek en geneeskunde om DNA te detecteren. PCR-tests worden gebruikt om antigenen te detecteren door hun DNA of RNA te detecteren. Over het algemeen is viraal RNA in het lichaam aanwezig voordat antilichamen worden gedetecteerd of de symptomen van de ziekte worden weergegeven. Een PCR-test kan al vroeg uitwijzen of iemand het virus heeft of niet. Momenteel is PCR de standaardtest voor het opsporen van de ziekte COVID-19. Er zijn verschillende soorten PCR-technieken zoals real-time PCR, geneste PCR, multiplex PCR, hot start PCR en lange-afstands PCR, enz.
Wat zijn conventionele PCR-assays?
Conventionele PCR-assay is een in vitro DNA-amplificatietechniek die routinematig wordt uitgevoerd in moleculair biologische laboratoria. Deze methode maakte de productie mogelijk van duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment. Kary Mullis introduceerde deze techniek in 1980. Deze techniek vereist een DNA-fragment dat bekend staat als de sjabloon om er veel kopieën van te maken. Taq-polymerase werkt als het DNA-polymerase-enzym en katalyseert de synthese van nieuwe strengen van de matrijssequentie.
Primers in het PCR-mengsel zullen werken als uitgangspunten voor de fragmentextensies. Alle ingrediënten die nodig zijn om kopieën van DNA te maken, zitten in het PCR-mengsel. PCR-reactie wordt uitgevoerd in een PCR-machine en deze moet worden gevoed met het juiste PCR-mengsel en het juiste PCR-programma. Als het reactiemengsel en het programma correct zijn, zal het uit een zeer kleine hoeveelheid DNA het vereiste aantal kopieën van een bepaald stuk DNA produceren.
Figuur 01: Conventionele PCR-assay
Er zijn drie belangrijke stappen betrokken bij een PCR-reactie: denaturatie, primer-annealing en strengverlenging. Deze drie stappen vinden plaats bij drie verschillende temperaturen. PCR-buffer handhaaft de optimale omstandigheden voor de Taq-polymerase-actie. Deze drie stadia van de PCR-reactie worden herhaald om de vereiste hoeveelheid van het PCR-product te produceren. Bij elke PCR-reactie verdubbelt het aantal DNA-kopieën. Daarom kan exponentiële amplificatie worden waargenomen in PCR. PCR-product kan worden opgelost met behulp van gelelektroforese, omdat het een zichtbare hoeveelheid DNA op een gel produceert, en het kan worden gezuiverd voor verder onderzoek, zoals sequencing.
PCR is een waardevol hulpmiddel in medisch en biologisch onderzoek. Vooral in forensische studies heeft PCR een enorme waarde, omdat het DNA kan versterken voor studies van de kleine monsters van de criminelen en forensische DNA-profielen kan maken. PCR wordt veel gebruikt in veel gebieden van de moleculaire biologie, waaronder genotypering, genklonering, mutatiedetectie, DNA-sequencing, DNA-microarrays en vaderschapstesten.
Wat zijn geneste PCR-assays?
Nested PCR is een type PCR dat de niet-specifieke amplificatie van DNA vermindert. Er zijn twee opeenvolgende PCR's of twee opeenvolgende amplificatiereacties in geneste PCR-assay. Tijdens de eerste amplificatiereactie wordt een PCR-product geproduceerd. Na de eerste reactie wordt een tweede amplificatiereactie uitgevoerd op het PCR-product van de eerste reactie. Daarom binden primers in het tweede reactiemengsel met het eerste PCR-product en versterken het.
Figuur 02: Geneste PCR
Primerparen zijn verschillend in elke reactie. De niet-specifieke binding van primers wordt verminderd in geneste PCR. Geneste PCR-assays zijn nuttig om de gevoeligheid en/of specificiteit te verhogen. Geneste PCR vereist echter kennis over de geïnteresseerde sequentie.
Wat zijn re altime PCR-assays?
Real-time PCR of kwantitatieve PCR (Q PCR) is een aangepaste versie van PCR die de PCR-producten kwantitatief meet. Daarom kwantificeert deze techniek de versterking in re altime met behulp van een re altime PCR-machine. Het is ook een geschikte methode om de hoeveelheid van een doelsequentie of gen in een monster te bepalen.
Het interessante van real-time PCR is dat het zowel versterking als echte kwantificering in één stap combineert. Daarom kan de noodzaak van gelelektroforese voor detectie worden geëlimineerd door de real-time PCR-techniek. Het gebruik van fluorescerende kleurstoffen om PCR-producten te labelen tijdens de PCR-reacties zal uiteindelijk leiden tot directe kwantificering. Wanneer de PCR-producten worden verzameld, worden ook de fluorescerende signalen verzameld en worden ze gemeten door de real-time machine. SYBR Green en Taqman zijn twee methoden om het amplificatieproces van de re altime PCR te detecteren of te bekijken. Beide methoden bewaken de voortgang van het amplificatieproces en rapporteren de hoeveelheid van het product in re altime.
Figuur 03: Re altime PCR
Real-time PCR heeft een breed scala aan toepassingen, zoals kwantificering van genexpressie, microRNA- en niet-coderende RNA-analyse, SNP-genotypering, detectie van kopienummervarianten, detectie van zeldzame mutaties, detectie van genetisch gemodificeerde organismen, en detectie van infectieuze agentia.
Wat zijn de overeenkomsten tussen conventionele geneste en real-time PCR-assays?
- Nested en real-time PCR-assays zijn modificaties van conventionele PCR-assays.
- Alle drie de technieken versterken DNA-monsters.
- Hun producten kunnen worden gebruikt bij sequencing of analyse.
- Deze testen vereisen primers.
Wat is het verschil tussen conventionele geneste en real-time PCR-assays?
Conventionele PCR is een techniek die is ontwikkeld om specifieke DNA-sequenties te amplificeren. Ondertussen is Nested PCR een modificatie van conventionele PCR die bestaat uit twee opeenvolgende amplificatiereacties, en real-time PCR is een variant van conventionele PCR die in staat is om het geamplificeerde product te kwantificeren. Dit is dus het belangrijkste verschil tussen conventionele geneste en re altime PCR-assays. In tegenstelling tot conventionele en real-time PCR, gebruikt geneste PCR twee primersets. Bovendien zijn er twee opeenvolgende amplificatiereacties in geneste PCR om niet-specifieke amplificatie te verminderen. bovendien bevatten de conventionele en real-time PCR-assays geen twee opeenvolgende amplificatiereacties.
De volgende infographic geeft een overzicht van de verschillen tussen conventionele geneste en real-time PCR-assays in tabelvorm voor vergelijking naast elkaar.
Samenvatting – Conventioneel versus genest versus re altime PCR-assays
Conventionele PCR is de eerste techniek die is ontwikkeld om specifieke DNA-fragmenten te amplificeren. Geneste PCR en real-time PCR zijn twee varianten van conventionele PCR. Er zijn twee opeenvolgende amplificatiereacties en het gebruik van twee primersets in geneste PCR. Real-time PCR is ontwikkeld om het geamplificeerde PCR-product te kwantificeren. Dit vat dus het verschil samen tussen conventionele geneste en real-time PCR-assays.
