Belangrijk verschil - Blunt vs Sticky End Ligation
Restrictie-endonucleasen zijn specifieke enzymen die dubbelstrengs DNA (dsDNA) knippen. Ze zijn ook bekend als moleculaire schaar in de moleculaire biologie. Restrictie-enzymen zijn in staat om specifieke korte sequenties van het dsDNA, bekend als herkenningsplaatsen, te herkennen en fosfodiester- en waterstofbindingen te splitsen om dubbele strengen te openen. Als gevolg van splitsing door deze enzymen worden DNA-fragmenten geproduceerd met verschillende soorten uiteinden, zoals kleverige uiteinden en stompe uiteinden. DNA-ligase is een enzym dat in de moleculaire biologie wordt gebruikt om twee aangrenzende DNA-strengen te verbinden door nieuwe bindingen te vormen. De stap staat bekend als ligatie en afhankelijk van het type van het DNA-uiteinde dat is geligeerd, kunnen ze worden aangeduid als ligatie met stompe uiteinden en ligatie met kleverige uiteinden. Het belangrijkste verschil tussen botte en kleverige ligatie is dat ligatie met stompe uiteinden plaatsvindt tussen DNA-fragmenten die twee stompe uiteinden bevatten, terwijl ligatie met kleverige uiteinden plaatsvindt tussen 5 'en 3' overhangen. Vergeleken met ligatie met stompe uiteinden, is ligatie met kleverige uiteinden efficiënter en stabieler.
Wat is een botte eindligatie?
Sommige restrictie-endonucleasen kunnen het DNA op de tegenovergestelde basen knippen en DNA-fragmenten met stompe uiteinden produceren. Deze enzymen staan bekend als blunt end cutters; ze klieven recht naar beneden naar het midden van de restrictieplaats zonder enkelstrengs overhangende bases achter te laten. Stompe uiteinden zijn ook bekend als niet-overhangende uiteinden, omdat ze geen 3' en 5' overhangende bases aan de uiteinden hebben. Beide strengen eindigen van basenparen in stompe uiteinden. Veel voorkomende bot-end snijdende enzymen zijn EcoRV HaeIII, AluI en SmaI.
Blunt-end ligatie is betrokken tussen twee stompe uiteinden. Het is geen ligatie van uitstekende basen. Deze ligatie is minder efficiënt dan ligatie met kleverige uiteinden. In sommige gevallen wordt ligatie van stompe uiteinden echter voordeliger dan ligatie met kleverige uiteinden, vooral bij het ligeren van PCR-producten. PCR-producten worden altijd met stompe uiteinden geproduceerd. Afbinding met stompe uiteinden vereist geen complementaire uiteinden in het DNA voor de ligatie.
Figuur 01: Productie van stompe uiteinden door Eco RV-enzym
Wat is een Sticky End Ligatie?
Sommige restrictie-endonucleasen zijn in staat om dsDNA te knippen, waarbij aan het einde een overhangend stuk enkelstrengs DNA achterblijft. Deze uiteinden staan bekend als kleverige of overhangende uiteinden. Ligatie van kleverige uiteinden vindt plaats tussen twee DNA-fragmenten die overeenkomende overhangen bevatten, omdat kleverige uiteinden bezeten zijn met ongepaarde basen en complementaire basen nodig hebben om bindingen te vormen. Daarom is het noodzakelijk om hetzelfde restrictie-enzym te gebruiken voor beide bronnen van DNA om de overeenkomende ligerende fragmenten te produceren.
Sticky end ligatie is efficiënter en is vaak zeer wenselijk bij kloonprocessen. Er zijn verschillende restrictie-enzymen die plakkerige uiteinden produceren. Het zijn EcoRI, BamHI, HindIII enz.
Figuur 02: Sticky end-productie door Eco RI-enzym
Wat is het verschil tussen Blunt en Sticky End Ligation?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Blunt-end ligatie vindt plaats tussen twee stompe-end DNA-fragmenten. | Sticky end ligatie vindt plaats tussen twee overeenkomende DNA-fragmenten met plakkerige uiteinden. |
| Enzymen | |
| Snijders met stompe uiteinden produceren stompe uiteinden. | Snijders met kleverige uiteinden produceren kleverige of samenhangende uiteinden. |
| Vereiste van bijpassende uiteinden | |
| Het vereist geen bijpassende fragmenten of complementaire basen. | Het vereist complementaire basen aan de uiteinden om basenparen te vormen. |
| Efficiëntie | |
| Het is minder efficiënt dan kleverige eindligatie | Het is efficiënter dan botte eindligatie. |
Samenvatting – Blunt vs Sticky End Ligation
Restrictie-endonucleasen zijn in staat dsDNA te splitsen en DNA-fragmenten met verschillende uiteinden te produceren. Ze herkennen specifieke sequenties en beperken het DNA waardoor kleverige en stompe uiteinden ontstaan. Kleverige uiteinden hebben ongepaarde basen aan het einde van de fragmenten. Stompe uiteinden worden gecreëerd door een rechte splitsing en ze hebben basenparen aan de uiteinden. Sticky end ligatie vereist twee complementaire enkelstrengs DNA-stukken. Afbinding met stompe uiteinden vindt plaats tussen twee fragmenten met stompe uiteinden. Dit is het verschil tussen botte en plakkerige ligatie.
