Belangrijk verschil – SYBR Green vs Taqman
SYBR Green en Taqman zijn twee methoden die worden gebruikt om het amplificatieproces van re altime PCR te detecteren of te bekijken. SYBR Green is een methode op basis van intercalerende kleurstof voor nucleïnezuur, terwijl Taqman een methode is op basis van een hydrolysesonde. Beide technologieën zijn ontworpen om fluorescentie te genereren tijdens de PCR, waardoor een re altime PCR-machine de reactie in "re altime" kan volgen. De SYBR Green-methode wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescerende kleurstof genaamd SYBR-groen en detecteert de amplificatie door de kleurstof te binden aan geproduceerd dubbelstrengs DNA. Taqman wordt uitgevoerd met behulp van dubbel gelabelde sondes en detecteert de amplificatie door afbraak van de sonde door Taq-polymerase en afgifte van de fluorofoor. Dit is het belangrijkste verschil tussen SYBR Green en Taqman.
Wat is SYBR Green?
SYBR Green is een fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om nucleïnezuren te kleuren, met name dubbelstrengs DNA in de moleculaire biologie. De SYBR Green-methode wordt gebruikt om PCR-producten te kwantificeren tijdens de re altime PCR. Zodra het zich bindt met DNA, absorbeert het resulterende DNA-kleurstofcomplex blauw licht en stra alt het intens groen licht uit. Het gebeurt vanwege de structurele verandering die optreedt in het kleurstofmolecuul bij binding met dubbelstrengs DNA. Wanneer PCR meer en meer DNA creëert, binden meer kleurstofmoleculen met DNA, waardoor er meer fluorescentie ontstaat. Daarom neemt de fluorescentie toe met de accumulatie van het PCR-product. Daarom kan de hoeveelheid PCR-product kwantitatief worden gemeten door de SYBR Green-fluorescentiedetectie.
SYBR groene kleurstof kan ook worden gebruikt voor DNA-labeling in cytometrie en fluorescentiemicroscopie. Ethidiumbromide is met succes vervangen door SYBR Green, aangezien ethidiumbromide een kankerverwekkende kleurstof is met verwijderingsproblemen tijdens DNA-visualisatie in de gelelektroforese.
Er zijn voor- en nadelen van de groene SYBR-methode. Deze methode is zeer gevoelig, goedkoop en gemakkelijk te gebruiken. Vanwege het vermogen om te binden aan elk dubbelstrengs DNA, kan niet-specifieke binding echter leiden tot overkwantificering van het PCR-product.
Figuur 01: SYBR Groene Techniek
Wat is Taqman?
Taqman is een alternatieve methode voor SYBR Green om het re altime PCR-proces te bewaken. Deze methode is afhankelijk van de 5'-3'-exonuclease-activiteit van het Taq-polymerase-enzym om de sondes af te breken tijdens de verlenging van de nieuwe streng en de afgifte van fluorofoor. Bij deze methode worden tweevoudig gelabelde sondes gebruikt en deze is gebaseerd op de hydrolyse van sondes. Probes zijn fluorescent gelabelde DNA-oligonucleotiden met een fluorescerend reportermolecuul (fluorofoor) aan het 5'-uiteinde en een quencher-molecuul aan het 3'-uiteinde. Ze zijn ontworpen om te binden aan de enkelstrengige sjabloon aan de andere kant van de primer-anneals. Taq-polymerase voegt nucleotiden toe aan de primer en verlengt de nieuwe streng naar de dubbel gelabelde probes. Zodra de Taq-polymerase de probe ontmoet, activeert en degradeert de exonuclease-actie van de Taq-polymerase de probe. Zodra de synthese van de nieuwe streng is voltooid, wordt de sonde onderworpen aan volledige afbraak en wordt de fluorofoor vrijgemaakt. De afgifte van fluorofoor genereert fluorescentie. Fluorescerende Quencher-molecuul dooft efficiënt het uitgestraalde licht en creëert de output voor kwantificering van het PCR-product. De afgifte van fluoroforen en de hoeveelheid van de PCR-producten zijn proportioneel. Daarom kan kwantificering eenvoudig worden gedaan met de Taqman-methode.
Figuur 02: Taqman-methode
Taqman-methode wordt gebruikt in re altime PCR, kwantificering van genexpressie, detectie van genetische polymorfismen, kwantificering van chromosomale DNA-deleties, bacteriële identificatie, verificatie van microarray-analyse, SNP-genotypering enz.
Wat is het verschil tussen SYBR green en Taqman?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green is gebaseerd op DNA-bindende kleurstof. | Taqman is afhankelijk van hybridisatieprobes en 5’ tot 3’ exonuclease-activiteit van Taq-polymerase. |
| Fluorescerend gelabelde sondes | |
| Er zijn geen fluorescent gelabelde sondes nodig. | Dubbel-gelabelde sondes zijn vereist. |
| Multiplex genanalyse | |
| Het kan niet worden gebruikt voor multiplex-gendoelen. | Het kan worden gebruikt voor multiplex-gendoelen. |
| Kosten | |
| Dit is goedkoper. | Dit is duurder. |
| Specificatie | |
| Dit is minder specifiek en bindt met elk dubbelstrengs DNA | Deze zijn zeer specifiek omdat sondes de specifieke amplificatieproducten detecteren. |
| Effectiviteit | |
| Dit is minder effectief. | Dit is zeer effectief. |
| Toepassing | |
| Dit wordt gebruikt in real-time PCR, agarosegelvisualisatie, DNA-labeling enz. | Dit wordt gebruikt in re altime PCR, kwantificering van genexpressie, detectie van genetische polymorfismen, enz. |
Samenvatting – SYBR Green en Taqman
Taqman en SYBR green zijn twee methoden die worden gebruikt in re altime PCR (kwantitatieve PCR). Beide methoden maken de kwantificering van het PCR-product efficiënt mogelijk en zijn afhankelijk van de emissie van de fluorescentie. De Taqman-methode maakt gebruik van dubbel gelabelde sondes voor detectie van het geaccumuleerde DNA, terwijl de SYBR Green-methode een fluorescerende kleurstof gebruikt. Beide methoden hebben ook verschillende toepassingen in de moleculaire biologie.
