Verschil tussen Northern Southern en Western Blotting

2024 Auteur: Alex Aldridge | [email protected]. Laatst gewijzigd: 2023-12-17 13:46

Belangrijk verschil - Noord versus zuid versus western blotting

Detectie van specifieke sequenties van DNA, RNA en eiwitten is essentieel voor verschillende soorten studies in de moleculaire biologie. Gelelektroforese is een techniek die DNA, RNA en eiwitten scheidt op basis van hun grootte. Uit de gelprofielen worden bepaalde DNA-sequenties, RNA-sequenties of eiwitten gedetecteerd door de speciale technieken die blotting en hybridisatie met gelabelde probes worden genoemd. Er zijn drie verschillende soorten blotting-methoden, namelijk zuidelijk, noordelijk en westelijk. Het belangrijkste verschil tussen Northern Southern en Western blotting ligt in het type molecuul dat het van een monster detecteert. Southern blotting is een methode die een specifieke DNA-sequentie uit een DNA-monster detecteert. Northern blotting is een techniek die een specifieke RNA-sequentie detecteert uit een RNA-monster. Western blotting is een methode die een specifiek eiwit uit een eiwitmonster detecteert.

Wat is Southern Blotting?

Southern-blottechniek is in 1975 ontwikkeld door E. M. Southern voor de identificatie van een specifieke DNA-sequentie uit een DNA-monster. Dit is de eerste blottechniek die in de moleculaire biologie is geïntroduceerd. Het maakte de detectie mogelijk van specifieke genen uit het DNA, specifieke fragmenten uit DNA, enz. Er zijn verschillende stappen betrokken bij de Southern blotting-techniek. Ze zijn als volgt.

1. DNA wordt uit het monster geïsoleerd en verteerd met restrictie-endonucleasen.
2. Verteerd monster wordt gescheiden door middel van agarosegelelektroforese.
3. DNA-fragmenten in de gel worden gedenatureerd tot enkele strengen met behulp van een alkalische oplossing.
4. Enkelstrengs DNA wordt overgebracht naar een nitrocellulosefiltermembraan door capillaire overdracht.
5. Overgedragen DNA wordt permanent op het membraan gefixeerd.
6. Vast DNA op het membraan wordt gehybridiseerd met gelabelde probes.
7. Ongebonden DNA wordt door wassen van het membraan afgewassen.
8. Röntgenfilm wordt blootgesteld aan het membraan en er wordt een autoradiografie gemaakt.

Southern blotting wordt toegepast voor verschillende aspecten van de moleculaire biologie. Het is nuttig bij RFLP-mapping, forensische studies, DNA-methylatie bij genexpressie, detectie van gemuteerde genen bij genetische aandoeningen, DNA-fingerprinting, enz.

Figuur 01: Southern Blotting-techniek

Wat is Northern Blotting?

Northern blotting is een methode die is ontworpen om een specifieke RNA-sequentie of mRNA-sequentie van een monster te detecteren om genexpressie te bestuderen. Deze techniek is in 1979 ontwikkeld door Alwine, Kemp en Stark. Het verschilt van de Sourthern en Western blotting-technieken door verschillende stappen. Deze techniek wordt echter ook uitgevoerd via gelelektroforese, blotting en hybridisatie met specifieke gelabelde probes en detectie. De Northern-blottechniek wordt als volgt uitgevoerd.

1. RNA wordt uit het monster geëxtraheerd en gescheiden door gelelektroforese.
2. RNA wordt van de gel op een blottingmembraan overgebracht en gefixeerd.
3. Het membraan wordt behandeld met een gelabelde probe bereid uit cDNA of RNA (de probe is complementair aan een specifieke sequentie in het monster).
4. De sonde wordt geïncubeerd met het membraan om te binden met een specifieke sequentie.
5. Ongebonden sondes worden weggewassen.
6. Gehybridiseerde fragmenten worden gedetecteerd door een autoradiografie.

Northern-blotting is een belangrijk hulpmiddel bij de detectie en kwantificering van gehybridiseerd mRNA, het bestuderen van RNA-afbraak, evaluatie van de RNA-halfwaardetijd, detectie van RNA-splitsing, het bestuderen van genexpressie, enz.

Figuur 02: Northern Blotting

Wat is Western Blotting?

Western blotting is een methode voor het detecteren van een specifiek eiwit uit een eiwitmengsel door gebruik te maken van gelabeld antilichaam. Daarom is western blot ook bekend als een immunoblot. Deze techniek werd in 1979 geïntroduceerd door Towbin et al. en wordt nu routinematig uitgevoerd in de laboratoria voor eiwitanalyse. De stappen zijn als volgt.

1. Eiwitten worden uit het monster gehaald
2. Eiwitten worden gescheiden door hun grootte met behulp van polyacrylamidegelelektroforese
3. Gescheiden moleculen worden door elektroporatie overgebracht naar een PVDF-membraan of nitrocellulosemembraan
4. Het membraan is geblokkeerd voor niet-specifieke binding met de antilichamen
5. Overgedragen eiwitten worden gebonden met primair antilichaam (enzym-gelabelde antilichamen).
6. Het membraan wordt gewassen om niet-specifiek gebonden primaire antilichamen te verwijderen
7. Gebonden antilichamen worden gedetecteerd door een substraat toe te voegen en het gevormde gekleurde neerslag te detecteren

Western-blotting is nuttig bij de detectie van anti-HIV-antilichamen in een menselijk serummonster. Western blot kan ook worden gebruikt als bevestigende test voor hepatitis B-infectie en definitieve test voor gekkekoeienziekte.

Figuur 03: Western Blotting

Wat is het verschil tussen Northern Southern en Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Type molecuul gedetecteerd
Northern Blotting	Northern-blotting detecteert een specifieke RNA-sequentie van een RNA-monster.
Southern Blotting	Southern blotting detecteert een specifieke DNA-sequentie van een DNA-monster.
Western Blotting	Western blotting detecteert een specifiek eiwit uit een eiwitmonster.
Type gel
Northern Blotting	Dit maakt gebruik van agarose/formaldehydegel.
Southern Blotting	Hier wordt een agarosegel gebruikt.
Western Blotting	Dit maakt gebruik van Polyacrylamide-gel.
Blotting-methode
Northern Blotting	Dit is een capillaire overdracht.
Southern Blotting	Dit is een capillaire overdracht.
Western Blotting	Dit is een elektrische overdracht.
Gebruikte sondes
Northern Blotting	cDNA- of RNA-probes radioactief of niet-radioactief gelabeld.
Southern Blotting	DNA-probes worden radioactief of niet-radioactief gelabeld.
Western Blotting	Primaire antilichamen worden gebruikt als probes.
Detectiesysteem
Northern Blotting	Dit wordt gedaan met behulp van een autoradiografie, of detectie van licht of kleurverandering.
Southern Blotting	Dit wordt gedaan met behulp van een autoradiografie, detectie van licht of kleurverandering.
Western Blotting	Dit wordt gedaan met behulp van de detectie van licht of kleurverandering.

Samenvatting - Noord versus Zuid versus Western Blotting

Blotting is een speciale techniek die is ontwikkeld voor de identificatie van specifiek DNA, RNA of eiwit uit de monsters. Er zijn drie afzonderlijke blotprocedures, namelijk Northern, Southern en Western, om een specifiek type molecuul te detecteren. De Northern-blottechniek is ontworpen om een specifieke RNA-sequentie uit een mengsel van RNA te detecteren. De Southern-blottechniek maakt de detectie van een specifieke DNA-sequentie van een DNA-monster mogelijk en de Western-blottechniek is ontwikkeld om een specifiek eiwit uit een eiwitmengsel te identificeren.