Belangrijk verschil – Nitrocellulose versus PVDF
Western blotting is een methode waarmee specifieke eiwitten uit een eiwitmonster kunnen worden gedetecteerd en gekwantificeerd. Betrouwbaarheid van de techniek hangt af van de selectie van een correct membraan voor absorptie van eiwitten uit de gel. Er zijn verschillende soorten microporeuze membranen. Nitrocellulose- en PVDF-membranen zijn twee van dergelijke membranen waaraan de onderzoekers de voorkeur geven vanwege hun speciale eigenschappen boven de andere soorten membranen. De selectie tussen nitrocellulose of PVDF is ook een andere uitdaging bij western blotting. Zowel nitrocellulose als PVDF hebben een hoog eiwitabsorptievermogen. Het belangrijkste verschil tussen nitrocellulose en PVDF-membraan is dat nitrocellulosemembranen niet het vermogen hebben om antilichamen te verwijderen en het membraan opnieuw te gebruiken voor het opnieuw testen van antilichamen, terwijl PVDF-membranen het vermogen hebben om te strippen en opnieuw te gebruiken.
Wat is nitrocellulose?
Nitrocellulose is een polymeer dat wordt vervaardigd door cellulose te behandelen met salpeterzuur en wordt gebruikt om microporeuze membranen te maken in de moleculaire biologie, met name voor blotting-technieken zoals Southern, Northern en Western blotting. Poriëngrootten van nitrocellulosemembranen variëren van 3 tot 20 µm. Nitrocellulose microporeuze membranen vergemakkelijken de detectie van immunochemische reacties die plaatsvinden op het oppervlak van het membraan. Daarom worden nitrocellulosemembranen vaak gebruikt voor immobilisatie van eiwitten en detectie van specifieke eiwitten bij western blotting. Nitrocellulosemembranen kunnen ook glycoproteïnen en nucleïnezuren immobiliseren.
Nitrocellulosemembranen hebben de voorkeur in laterale flow-assays vanwege verschillende kenmerken. Nitrocellulosemembranen absorberen eiwitten in een hoge concentratie. Het oplosmiddel dat wordt gebruikt om het membraan te bevochtigen, vermindert de absorptie van nitrocellulosemembraaneiwit niet. Nitrocellulosemembranen kunnen gemakkelijk op de gewenste gelgrootte worden gesneden en eiwitten van de gel naar het membraan overbrengen door elektrische of capillaire overdracht. Nitrocellulose zorgt voor een snellere doorstroming van eiwitten door het membraan met een hoog bindingspotentieel. Nitrocellulose vertoont een verbeterde hanteringssterkte. Een ander speciaal kenmerk van nitrocellulosemembraan is dat het gemakkelijk kan worden gelijmd met niet-oplosmiddelwaterbestendige lijmen op verschillende plastic ruggen.
Figuur 01: Nitrocellulosemembraan voor western blotting
Wat is PVDF?
Polyvinylideendifluoride (PVDF) is een fluorpolymeer dat wordt geproduceerd door de polymerisatie van vinylideendifluoride en heeft een hoog immobilisatievermogen van eiwitten. Daarom worden microporeuze membranen gemaakt van PVDF gebruikt in western blotting-technieken om specifieke eiwitten uit de mengsels van eiwitten te analyseren. PVDF-membranen kunnen ook worden gebruikt voor aminozuuranalyse en eiwitsequencing. Het belangrijkste kenmerk van PVDF-membraan over nitrocellulosemembraan is dat het gemakkelijk van de antilichamen kan worden verwijderd en opnieuw kan worden gebruikt voor daaropvolgende antilichaamsondes.
PVDF-membranen zijn dikker dan nitrocellulosemembranen; daarom beter bestand tegen beschadigingen tijdens hergebruik. PVDF-membranen zijn zeer hydrofoob. Daarom moeten ze voor gebruik in methanol of isopropanol worden geweekt.
Wat is het verschil tussen nitrocellulose en PVDF?
Nitrocellulose versus PVDF |
|
| Nitrocellulose is een polymeer dat is samengesteld uit cellulose. | PVDF is een fluorpolymeer geproduceerd door de polymerisatie van vinylideendifluoride. |
| Membraanporiegrootte | |
| Typische poriegroottes zijn 0,1, 0,2 of 0,45μ | Typische poriegroottes zijn 0,1, 0,2 of 0,45 m |
| Eiwitbindingscapaciteit | |
| Nitrocellulose heeft een eiwitbindend vermogen van 80 tot 100 μg/cm2. | PVDF heeft een eiwitbindingscapaciteit van 170 tot 200 g/cm2. |
| Gevoeligheid | |
| Dit heeft een lage gevoeligheid in vergelijking met PVDF. | Dit heeft een hoge gevoeligheid. |
| Detectie van laag tot expressie gebrachte eiwitten | |
| Omdat de gevoeligheid van nitrocellulosemembranen laag is, is het niet geschikt voor de detectie van laag tot expressie gebrachte eiwitten. | Dit is meer geschikt voor de detectie van laag tot expressie gebrachte eiwitten vanwege de hoge gevoeligheid. |
| Achtergrondruis | |
| Dit heeft minder achtergrondgeluid | Dit heeft meer achtergrondgeluid. |
| Interacties met eiwitten | |
| Eiwitmoleculen binden aan nitrocellulosemembranen door hydrofobe interacties. | Eiwitten binden aan PVDF-membranen door hydrofobe en dipoolinteracties. |
| Natuur van het membraan | |
| Nitrocellulose is broos en kwetsbaar. Er zijn echter versies van nitrocellulose beschikbaar en ze zijn resistent. | PVDF is duurzamer en heeft een hogere chemische weerstand. |
| Mogelijkheid om te strippen en opnieuw te gebruiken | |
| Nitrocellulose kan moeite hebben met strippen en opnieuw testen zonder het signaal te verliezen. | PVDF is ideaal voor het herbemonsteren en rangschikken van toepassingen. |
| Geschiktheid | |
| Nitrocellulose is ideaal voor het detecteren van eiwitten met een laag molecuulgewicht. | PVDF is meer geschikt voor het detecteren van eiwitten met een hoger molecuulgewicht. |
| Andere toepassingen | |
| Nitrocellulose kan worden gebruikt voor nucleïnezuuranalyse en dot/slot-blotting. | PVDF kan worden gebruikt voor eiwitsequencing en vaste-fase-assaysystemen. |
| Kosten | |
| Dit is goedkoper dan PVDF-membranen. | Dit is duurder dan nitrocellulosemembranen. |
| Voorbevochtiging nodig | |
| Nitrocellulosemembranen hoeven niet vooraf te worden geweekt met methanol | PVDF-membranen moeten vooraf worden geweekt met methanol. |
Samenvatting – Nitrocellulose versus PVDF
Nitrocellulosemembranen waren de eerste membranen die commercieel werden gebruikt voor laterale flow-assays. Ze hebben een hoog vermogen om eiwitten op te nemen. Daarom worden nitrocellulosemembranen gebruikt bij western blotting. PVDF is een ander type membraan dat wordt gebruikt bij western blotting en het heeft ook een hoog eiwitabsorptievermogen. Beide typen worden gebruikt bij western blotting voor eiwitanalyse. PVDF-membranen hebben echter meer speciale eigenschappen, waardoor ze geschikter zijn dan nitrocellulosemembranen voor western blotting. Maar nitrocellulosemembranen zijn meer geschikt voor het detecteren van eiwitten met een laag molecuulgewicht, en PVDF-membranen zijn meer geschikt voor het detecteren van eiwitten met een hoog molecuulgewicht. Dit is het verschil tussen nitrocellulose- en PVDF-membranen.
