Belangrijk verschil – T4 vs T7 DNA-ligase
DNA-ligase is een belangrijk enzym dat wordt gebruikt in moleculair-biologische technieken. Het functioneert als een moleculaire lijm om nucleotiden te verbinden door fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden te vormen. De fosfodiesterbindingen worden gevormd tussen het 3'-hydroxyluiteinde van de suikergroep en de 5'-uiteinde fosfaatgroep. DNA-ligase is van vitaal belang in het replicatieproces om de Okazaki-fragmenten van de achterblijvende streng te verbinden en tijdens DNA-reparatiemechanismen en in vitro kloneringsexperimenten om het gewenste gen van belang aan het vectorgenoom te koppelen. Er zijn twee belangrijke DNA-ligasen die momenteel door moleculair biologen worden gebruikt: T4- en T7-DNA-ligasen. T4-DNA-ligase is een van de eerste enzymen die uit de T4-bacteriofaag wordt geïsoleerd. T7 DNA-ligase, een kleiner eiwit, is een enzym dat wordt geïsoleerd uit T7-bacteriofaag. Dit is het belangrijkste verschil tussen T4- en T7-DNA-ligasen.
Wat is de werking van DNA-ligase?
DNA-ligatie vindt plaats in een reactie in drie stappen. De eerste stap is een nucleofiele aanval op de alfa-fosfor van ATP die een covalent enzym-adenylaat-tussenproduct genereert waarin AMP is gekoppeld aan de terminale zijketenstikstof van lysine. In de tweede stap vindt een nucleofiele aanval plaats op het fosfor van het enzym-adenylaat door het 5'-fosfaat-getermineerde DNA-substraat, waarbij lysine vrijkomt en DNA-adenylaat wordt gevormd. In de laatste stap wordt DNA-adenylaat aangevallen door 3'-OH van een andere DNA-streng, waardoor AMP vrijkomt en de polynucleotiden worden samengevoegd.
Wat is T4 DNA-ligase?
T4 Ligase was de eerste ligase die werd geïsoleerd en geïdentificeerd door Meselson, Weigle en Kellenberger en was de eerste commerciële ligase die ooit werd geproduceerd. T4-DNA-ligase is een ATP-afhankelijk enzym dat de vorming van fosfodiesterbindingen katalyseert. Het is een enkele polypeptideketen met 487 aminozuurresiduen en heeft een molecuulgewicht van ongeveer 77 kDa. De optimale pH voor zijn activiteit ligt in het bereik van 7,5 – 8.
Figuur 01: T4 DNA-ligase
T4 DNA-ligase, zoals de naam al doet vermoeden, is aanwezig in bacteriofaag T4 en werd geïsoleerd toen faag het enzym produceerde na infectie met E. coli. Het enzym ligeert dubbelstrengs DNA-duplexen met stompe uiteinden en de te binden fragmenten moeten dicht bij elkaar liggen.
Wat is T7 DNA-ligase?
T7-ligase is een eiwit van 41 kDa dat wordt geproduceerd door T7 Bacteriofaag en wordt geïsoleerd door E. coli-cellen te infecteren. De belangrijkste functie van T7-ligase is het ligeren van DNA-duplexen door middel van fosfodiesterbindingen en het samenvoegen van nabijgelegen DNA-fragmenten tijdens kloneringsexperimenten. De optimale pH voor T7 DNA-ligase ligt in het bereik van 7,0 – 7,2. T7-ligase is ATP-afhankelijk. T7-DNA-ligasen zijn ook in staat om DNA- en RNA-hybriden te hybridiseren, wat aanleiding geeft tot abnormale conformaties tijdens transcriptie; dit fenomeen wordt echter nog steeds onderzocht door in vitro-onderzoeken.
Wat zijn de overeenkomsten tussen T4- en T7-DNA-ligase?
- T4- en T7-DNA-ligase nemen deel aan een ligatiereactie door DNA-duplexen te annealen door vorming van fosfodiesterbindingen tussen het 3'-OH-uiteinde en het 5'-fosfaatuiteinde van het DNA-fragment.
- Beide enzymen binden DNA-duplexen met stompe uiteinden die dicht bij elkaar liggen.
- Beide enzymen zijn ATP-afhankelijk.
- Deze enzymen worden geïsoleerd door E. coli-cellen te infecteren met de specifieke bacteriofaag.
- Toepassingen van beide enzymen zijn:
- Moleculair klonen – om het gen van belang te ligeren aan de vector
- DNA-reparatie – om dubbelstrengs nissen te repareren
- In vitro DNA-replicatie
- Ligase kettingreactie
Wat is het verschil tussen T4- en T7-DNA-ligase?
T4 vs T7 DNA-ligase |
|
| T4 DNA-ligase type DNA-ligase geïsoleerd uit de bacteriofaag T4 en is betrokken bij het ligeren van aangrenzende DNA-fragmenten via vorming van fosfodiesterbindingen. | T7 DNA-ligase type DNA-ligase geïsoleerd uit de bacteriofaag T7 en is betrokken bij het ligeren van aangrenzende DNA-fragmenten via vorming van fosfodiesterbindingen. |
| Grootte van het eiwit | |
| Grootte van T4 DNA-ligase is 77 kDa – groter in vergelijking met T7 DNA-ligase. | Grootte van T7 DNA-ligase is 41 kDa. |
| Optimale pH | |
| pH-bereik dat werkt T4 DNA-ligase is 7,5 – 8,0. | pH-bereik dat werkt T7 DNA-ligase is 7,0 – 7,2. |
Samenvatting – T4 vs T7 DNA-ligase
DNA-ligasen zijn een belangrijke klasse van enzymen die betrokken zijn bij moleculaire klonering om recombinante DNA-moleculen te produceren die het gen van belang bevatten. Ligatiereactie is een energiegebruikende reactie en er zijn nieuwe onderzoeken gaande om de nauwkeurigheid te verbeteren door de beschikbare ligasen te moduleren. T4- en T7-DNA-ligasen zijn twee soorten belangrijke DNA-ligase-enzymen die worden gebruikt in moleculair biologische technieken. T7 DNA-ligase is ook een resultaat van onderzoek dat was gebaseerd op het primaire ligase dat werd geïsoleerd uit met T4 geïnfecteerde E. coli. T7 wordt weergegeven met meer efficiëntie en nauwkeurigheid bij het uitvoeren van zijn functie vanwege zijn kleinere formaat. Dit is het verschil tussen T4- en T7-ligase.
Download PDF-versie van T4 vs T7 DNA Ligase
U kunt de PDF-versie van dit artikel downloaden en gebruiken voor offline doeleinden volgens de citatienotities. Download hier de PDF-versie. Verschil tussen T4 en T7 Ligase.
