Het belangrijkste verschil tussen Golden Gate en Gibson Assembly is dat Golden Gate vertrouwt op de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde sequentie die moet worden gekloond, terwijl Gibson Assembly niet afhankelijk is van de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde sequentie om gekloond worden.
In de afgelopen decennia hebben moleculaire wetenschappers verschillende gestandaardiseerde procedures ontwikkeld die het gemakkelijker maken om meerdere DNA-fragmenten tot een enkel stuk samen te voegen. Daarom worden kloneringsmethoden zoals Restriction Enzyme Ligation, Gateway Cloning, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly en TOPO Cloning veel gebruikt door onderzoekers in wetenschappelijke experimenten. Daarom zijn Golden Gate en Gibson Assembly twee moleculaire kloneringsmethoden die de assemblage van meerdere DNA-fragmenten tot een enkel stuk mogelijk maken.
Wat is Golden Gate Assembly?
Golden Gate is een moleculaire kloonmethode die de assemblage van meerdere DNA-fragmenten tot een enkel stuk vergemakkelijkt. Deze methode berust op de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde te kloneren sequentie. Het is ontstaan in 1996. Deze techniek maakt gebruik van Type IIS-restrictie-enzymen en T4-DNA-ligase. Deze enzymen knippen DNA buiten de herkenningsplaatsen. Ze kunnen niet-palindroom overhangen creëren. Daarom kunnen meerdere DNA-fragmenten worden geassembleerd met behulp van combinaties van overhangende sequenties.
Figuur 01: Golden Gate
Golden Gate-montageprocedure
Golden Gate-techniek heeft drie hoofdstappen in zijn procedure:
- creatie van overhangen in de kloonvector,
- assemblage van meerdere DNA-inserts met behulp van fragmentspecifieke sequenties in overhangen, en
- ligatie.
Golden Gate-assemblage gebruikt cirkelvormige kloonvectoren (bestemmingsvector). Bovendien wordt bij deze methode de restrictieplaats geëlimineerd uit het geligeerde product om tegelijkertijd digestie en ligatie uit te voeren. Een typisch thermisch cyclusprotocol voor Golden Gate schommelt tussen 37 °C en 16 °C omdat 37 °C optimaal is voor restrictie-enzymen en 16 °C optimaal is voor ligasen.
Wat is Gibson Assembly?
Gibson Assembly is een moleculaire kloonmethode waarmee meerdere DNA-fragmenten tot één stuk kunnen worden samengevoegd. In tegenstelling tot de Golden Gate-methode, is deze methode niet afhankelijk van de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde te klonen sequentie. Het werd gevonden door Daniel G. Gibson van het J. Craig Venter Institute. Deze techniek is een soort sequentie- en ligase-onafhankelijke klonering (SLIC)-methode.
Figuur 02: Gibson-assemblage
Gibson-montageprocedure
Gibson Assembly heeft DNA-fragmenten nodig die 20-40 basenparen bevatten die overlappen met aangrenzende DNA-fragmenten. Overlappingen worden toegevoegd via PCR. Vervolgens worden deze DNA-fragmenten toegevoegd aan het Gibson-masermengsel dat drie enzymen bevat. Deze procedure wordt uitgevoerd onder isotherme omstandigheden (50 °C gedurende 1 uur) met behulp van drie verschillende enzymen: exonuclease, DNA-polymerase en DNA-ligase. Het exonuclease kauwt DNA terug vanaf het 5'-uiteinde. Het remt dus de polymerase-activiteit niet en laat de reactie in één enkel proces verlopen. De resulterende enkelstrengs regio's op aangrenzende DNA-fragmenten kunnen worden versmolten vanwege overlappende sequenties. DNA-polymerase vult de gaten op door nucleotiden toe te voegen. Ten slotte verbindt het DNA-ligase covalent met het DNA van aangrenzende segmenten. Normaal gesproken gebruikt Gibson Assembly gelineariseerde bestemmingsvectoren. Bovendien kan deze methode tegelijkertijd tot 15 DNA-fragmenten combineren op basis van sequentieovereenkomst.
Overeenkomsten tussen Golden Gate en Gibson Assembly
- Golden Gate en Gibson Assembly zijn twee moleculaire kloonmethoden.
- Beide methoden kunnen meerdere DNA-fragmenten samenvoegen tot één stuk.
- Deze methoden gebruiken bestemmingsvectoren.
- Beide methoden maken gebruik van thermische cyclers voor de assemblage van meerdere DNA-fragmenten.
- Ze worden gebruikt in plaatsgerichte mutagenese.
Verschil tussen Golden Gate en Gibson Assembly
Golden Gate is een moleculaire kloonmethode die wordt gebruikt bij de assemblage van meerdere DNA-fragmenten in een enkel stuk, afhankelijk van de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde te klonen sequentie, terwijl Gibson Assembly een moleculaire kloonmethode is die wordt gebruikt in de assemblage van meerdere DNA-fragmenten tot een enkel stuk zonder te vertrouwen op de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde te klonen sequentie. Dit is het belangrijkste verschil tussen Golden Gate en Gibson Assembly. Bovendien gebruikt de Golden Gate-methode een cirkelvormige bestemmingsvector, terwijl de Gibson Assembly-methode een gelineariseerde bestemmingsvector gebruikt.
De volgende infographic geeft het verschil weer tussen Golden Gate en Gibson Assembly.
Samenvatting – Golden Gate vs Gibson Assembly
Moleculair klonen is een methode die wordt gebruikt om recombinante DNA-moleculen samen te stellen en hun replicatie in gastheerorganismen te sturen. Golden Gate en Gibson Assembly zijn twee moleculaire kloneringsmethoden die de assemblage van meerdere DNA-fragmenten tot een enkel stuk mogelijk maken. De Golden Gate-methode is afhankelijk van de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde te klonen sequentie, terwijl Gibson Assembly niet afhankelijk is van de aanwezigheid van restrictieplaatsen binnen een bepaalde te klonen sequentie. Dit is dus het belangrijkste verschil tussen Golden Gate en Gibson Assembly.
