Belangrijk verschil - Microarray versus RNA-sequencing
Transcriptoom vertegenwoordigt de volledige inhoud van RNA dat aanwezig is in een cel, inclusief mRNA, rRNA, tRNA, afgebroken RNA en niet-afgebroken RNA. Het profileren van transcriptoom is een belangrijk proces om de celinzichten te begrijpen. Er zijn verschillende geavanceerde methoden voor transcriptoomprofilering. Microarray- en RNA-sequencing zijn twee soorten technologieën die zijn ontwikkeld om transcriptoom te analyseren. Het belangrijkste verschil tussen microarray en RNA-sequencing is dat microarray is gebaseerd op het hybridisatiepotentieel van vooraf ontworpen gelabelde probes met doel-cDNA-sequenties, terwijl RNA-sequencing is gebaseerd op de directe sequencing van cDNA-strengen door geavanceerde sequencing-technieken zoals NGS. Microarray wordt uitgevoerd met de voorkennis over de sequenties en RNA-sequencing wordt uitgevoerd zonder de voorkennis over sequenties.
Wat is Microarray?
Microarray is een robuuste, betrouwbare en high-throughput-methode die door wetenschappers wordt gebruikt voor transcriptoomprofilering. Het is de meest populaire methode voor transcriptieanalyse. Het is een goedkope methode, die afhankelijk is van de hybridisatieprobes.
De techniek begint met extractie van mRNA uit het monster en de constructie van een cDNA-bibliotheek uit totaal RNA. Vervolgens wordt het gemengd met fluorescent gelabelde, vooraf ontworpen sondes op een vast oppervlak (spotmatrix). Complementaire sequenties hybridiseren met de gelabelde probes in de microarray. Vervolgens wordt de microarray gewassen en gescreend en wordt het beeld gekwantificeerd. Verzamelde gegevens moeten worden geanalyseerd om de relatieve expressieprofielen te krijgen.
De intensiteit van de microarray-probes wordt verondersteld evenredig te zijn met de hoeveelheid transcripten in het monster. De nauwkeurigheid van de techniek hangt echter af van de ontworpen probes, voorkennis van de sequentie en de affiniteit van probes voor hybridisatie. Daarom heeft microarray-technologie beperkingen. Microarray-techniek kan niet worden uitgevoerd met transcripten met een lage abundantie. Het slaagt er niet in isovormen te differentiëren en genetische varianten te identificeren. Aangezien deze methode afhankelijk is van hybridisatie van probes, treden er bij de microarraytechniek enkele problemen op die verband houden met hybridisatie, zoals kruishybridisatie, niet-specifieke hybridisatie enz.
Figuur 01: Microarray
Wat is RNA-sequencing?
RNA shotgun sequencing (RNA seq) is een recent ontwikkelde techniek voor het sequencen van hele transcriptooms. Het is een snelle en snelle methode voor transcriptoomprofilering. Het kwantificeert direct de expressie van genen en resulteert in diepgaand onderzoek van het transcriptoom. RNA-seq is niet afhankelijk van vooraf ontworpen sondes of voorkennis van de sequenties. Daarom heeft de RNA-seq-methode een hoge gevoeligheid en het vermogen om nieuwe genen en genetische varianten te detecteren.
RNA-sequencingmethode wordt uitgevoerd via verschillende stappen. Totaal RNA van de cel moet worden geïsoleerd en gefragmenteerd. Vervolgens moet met behulp van reverse transcriptase een cDNA-bibliotheek worden aangemaakt. Elke cDNA-streng moet worden geligeerd met adapters. Vervolgens moeten de geligeerde fragmenten worden geamplificeerd en gezuiverd. Ten slotte moet met behulp van een NGS-methode de sequentiebepaling van het cDNA worden uitgevoerd.
Figuur 02: RNA-sequencing
Wat is het verschil tussen Microarray en RNA-sequencing?
Microarray versus RNA-sequencing |
|
| Microarray is een robuuste, betrouwbare methode met hoge doorvoer. | RNA-sequencing is een nauwkeurige methode met hoge doorvoer. |
| Kosten | |
| Dit is een goedkope methode. | Dit is een dure methode. |
| Analyse van een groot aantal monsters | |
| Dit vergemakkelijkt de analyse van een groot aantal monsters tegelijk. | Dit vergemakkelijkt het analyseren van een groot aantal monsters. |
| Gegevensanalyse | |
| Data-analyse is complex. | Er worden meer gegevens gegenereerd in deze methode; daarom is het proces complexer. |
| Voorkennis van sequenties | |
| Deze methode is gebaseerd op hybridisatieprobes, dus voorkennis van sequenties is vereist. | Deze methode is niet afhankelijk van de voorkennis van de volgorde. |
| Structurele variaties en nieuwe genen | |
| Deze methode kan geen structurele variaties en nieuwe genen detecteren. | Deze methode kan structurele variaties detecteren, zoals genfusie, alternatieve splicing en nieuwe genen. |
| Gevoeligheid | |
| Dit kan geen verschillen in expressie van isovormen detecteren, dus dit heeft een beperkte gevoeligheid. | Dit heeft een hoge gevoeligheid. |
| Resultaat | |
| Dit kan alleen resulteren in relatieve expressieniveaus. Dit geeft geen absolute kwantificering van genexpressie. | Het geeft absolute en relatieve expressieniveaus. |
| Heranalyse van gegevens | |
| Dit moet opnieuw worden uitgevoerd om opnieuw te kunnen analyseren. | Sequencing-gegevens kunnen opnieuw worden geanalyseerd. |
| Behoefte aan specifiek personeel en infrastructuur | |
| Specifieke infrastructuur en personeel zijn niet vereist voor microarray. | Specifieke infrastructuur en personeel vereist voor RNA-sequencing. |
| Technische problemen | |
| Microarray-techniek heeft technische problemen zoals kruishybridisatie, niet-specifieke hybridisatie, beperkte detectiesnelheid van individuele probes, enz. | RNA seq-techniek vermijdt technische problemen zoals kruishybridisatie, niet-specifieke hybridisatie, beperkte detectiesnelheid van individuele probes, enz. |
| Vooroordelen | |
| Dit is een bevooroordeelde methode omdat deze afhankelijk is van hybridisatie. | Bias is laag in vergelijking met microarray. |
Samenvatting – Microarray versus RNA-sequencing
Microarray- en RNA-sequencingmethoden zijn high-throughput-platforms die zijn ontwikkeld voor transcriptoomprofilering. Beide methoden produceren resultaten die sterk gecorreleerd zijn met genexpressieprofielen. RNA-sequencing heeft echter voordelen ten opzichte van microarray voor analyse van genexpressie. RNA-sequencing is een meer gevoelige methode voor de detectie van transcripten met een lage abundantie dan microarray. RNA-sequencing maakt ook de differentiatie tussen isovormen en identificatie van genvarianten mogelijk. Microarray is echter de gebruikelijke keuze van de meeste onderzoekers, aangezien RNA-sequencing een nieuwe en dure techniek is met uitdagingen op het gebied van gegevensopslag en complexe gegevensanalyse.
