Belangrijk verschil - Warm versus koud trypsinisatie
Warme en koude trypsinisatie zijn twee methoden die worden gebruikt bij enzymatische desaggregatie van cellen bij het kweken van dierlijke cellen. Het belangrijkste verschil tussen warme en koude trypsinisatie, zoals de namen suggereren, hangt af van de temperatuur waarbij de trypsine wordt toegevoegd voor cellulaire desaggregatie. Warme trypsinisatie vindt plaats onder hogere temperatuuromstandigheden (36,5 – 37 0C), terwijl koude trypsinisatie plaatsvindt onder lage temperatuur.
Tijdens het proces van primaire celkweek van dierlijke cellen, zijn er drie hoofdmethoden gebruikt die succesvol zijn gebleken. De drie methoden omvatten mechanische desaggregatie van cellen, enzymatische desaggregatie van cellen en de primaire explantatietechniek. De enzymatische desaggregatie van cellen leidt tot de isolatie van cellen en wordt gedaan door het eiwitafbrekende enzym trypsine. Daarom staat dit proces bekend als trypsinisatie. Trypsinisatie kan worden gedaan onder twee verschillende omstandigheden, namelijk warme trypsinisatie en koude trypsinisatie. Warme trypsinisatie is de methode om de cellen te behandelen met trypsine onder warme omstandigheden bij een temperatuur van 36,5 – 37 0C. Koude trypsinisatie is het proces van trypsinebehandeling dat plaatsvindt onder koudere omstandigheden, bij voorkeur in ijs met zeer lage temperaturen.
Wat is warme trypsinisatie?
Trypsinisatie kan worden gedaan om de cellulaire componenten te desaggregeren om de cellen te isoleren om een primaire celcultuur te produceren. Trypsine is een eiwitafbraak-enzym en het enzymmengsel dat bij trypsinisatie wordt gebruikt, kan een ruw extract of een gezuiverd product zijn. Van het ruwe extract wordt gezegd dat het efficiënter is in eiwitlysis en celdesintegratie omdat het andere afbrekende enzymen bevat.
Warme trypsinisatie is de meest gebruikte enzymatische methode voor celdesaggregatie die plaatsvindt onder hogere temperatuuromstandigheden. Voorafgaand aan de behandeling door trypsinisatie wordt het gewenste weefsel in kleinere stukjes gehakt. Het vergemakkelijkt het eenvoudige desaggregatieproces. Het gehakte weefsel wordt vervolgens gewassen in een speciaal medium dat bekend staat als het Dissection Basal S alt-medium.
Na voltooiing van de wasstap worden de cellen getransformeerd in een kolf die het actieve enzym trypsine bevat. Aangezien deze techniek een warm trypsinisatieprotocol impliceert, wordt de trypsine gedurende ongeveer vier uur op een temperatuur van ongeveer 37 0C geplaatst.
Figuur 01: Trypsine
De inhoud wordt gemengd en geroerd met behulp van centrifugatiemethoden voor het gemak van het protocol en om het desaggregatieproces te versnellen. Zodra de aanbevolen tijd is bereikt, kunnen de cellen worden afgeleid van het supernatant. De cellen die zijn afgeleid van het supernatant worden vervolgens bij een bepaalde temperatuur en tijd geïncubeerd.
Wat is koude trypsinisatie?
Koude trypsinisatie is het andere type trypsinisatie dat plaatsvindt onder koude omstandigheden. Bij deze techniek worden de cellen die worden gehakt en gewassen in flesjes op ijs geplaatst en vervolgens gedrenkt in trypsine. De inweektijd is veel langer – ongeveer 6 – 24 uur.
Na voltooiing van de inweekprocedure wordt de trypsine uit het cellysaat verwijderd en worden de stukjes weefsel gedurende ongeveer 20-30 minuten bij 37 0C verder geïncubeerd. De desaggregatie van de cellen wordt bewerkstelligd door herhaald pipetteren van het weefselmengsel. Hierdoor kunnen de cellen dissociëren van het membraan en naar het supernatant komen. Zodra de cellen zich in het supernatant bevinden, worden ze geïncubeerd en gekweekt bij een gewenste temperatuur en tijdsperiode.
De koude trypsinisatiemethode heeft verschillende voordelen
- Hogere opbrengst aan levensvatbare cellen omdat de celbeschadiging wordt geminimaliseerd. De celbeschadiging wordt geminimaliseerd door geen centrifugatiestappen te gebruiken.
- Zeer handige methode.
- Minder arbeidsintensief.
De belangrijkste beperking van de koude trypsinisatiemethode is dat grote hoeveelheden niet in één keer kunnen worden gebruikt.
Wat zijn de overeenkomsten tussen warme en koude trypsinisatie?
- Zowel warme als koude trypsinisatieprocessen gebruiken het enzym trypsine voor de desaggregatie van cellen.
- Zowel warme als koude trypsinisatieprocessen worden gebruikt in celkweekprocedures voor de desaggregatie van cellen.
- In zowel warme als koude trypsinisatiebehandelingsprocedures worden de cellen afgeleid van het supernatant.
Wat is het verschil tussen warme en koude trypsinisatie?
Warm versus koud trypsinisatie |
|
| Warme trypsinisatie is de methode om de cellen te behandelen met trypsine onder warme omstandigheden bij een temperatuur van 36,5 – 37 0. | Koude trypsinisatie is het proces van trypsinebehandeling dat plaatsvindt onder koudere omstandigheden, bij voorkeur in ijs met zeer lage temperaturen. |
| Protocol | |
| De gehakte stukjes weefsel worden gedurende de hele procedure continu op 37 0C gehouden. | De gehakte stukjes weefsel worden aanvankelijk op ijskoude temperaturen gehouden en vervolgens op 37 0. gehouden |
| Temperatuur | |
| Warme trypsinisatie vindt plaats bij 36.5 – 37 0 | Koude trypsinisatie vindt plaats bij ijskoude temperaturen. |
| Verbruikte tijd | |
| Kortere tijd nodig voor het hele proces (ongeveer 4 uur) van warme trypsinisatie. | Langere tijd nodig (ongeveer 6 – 24 uur) voor koude trypsinisatie. |
| Opbrengst van levensvatbare cellen | |
| Laag in warme trypsinisatie. | Hoog in koude trypsinisatie. |
| Gebruik van centrifugeren | |
| Centrifugatie is vereist voor de desaggregatie van cellen bij warme trypsinisatie. | Centrifugeren is niet vereist bij koude trypsinisatie. |
| Aanvankelijke hoeveelheid weefsel voor trypsinisatie | |
| Een grotere hoeveelheid weefsel kan worden gebruikt bij warme trypsinisatie. | Een kleinere hoeveelheid weefsel kan worden gebruikt bij koude trypsinisatie. |
| Celschade | |
| Hoog door centrifugeren in warme trypsinisatie. | Minder door koude trypsinisatie. |
Samenvatting - Warm versus koud trypsinisatie
Trypsinisatie is de methode waarbij het eiwitafbrekende enzym trypsine wordt gebruikt voor de desaggregatie en bereiding van primaire celculturen tijdens het celkweekproces. Er zijn twee hoofdtechnieken voor trypsinisatie op basis van de temperaturen die tijdens de procedure worden gebruikt. Ze zijn warm en koud trypsinisatie. Warme trypsinisatie wordt uitgevoerd bij 37 0C, terwijl koude trypsinisatie wordt uitgevoerd onder ijskoude omstandigheden. Hoewel koude trypsinisatie meer tijd nodig heeft om te voltooien, wordt gezegd dat het een hogere opbrengst aan levensvatbare cellen heeft. Dit is te wijten aan het feit dat celbeschadiging wordt geminimaliseerd bij koude trypsinisatie, omdat er geen krachtige centrifugatiestappen worden gebruikt. Dit is het verschil tussen warme en koude trypsinisatie.
