Belangrijk verschil – Klonen versus subklonen
Klonen en subklonen zijn moleculair biologische procedures die genetisch identieke cellen of organismen creëren die het DNA of gen dragen dat van belang is. Klonen is een techniek waarbij het geïnteresseerde gen of DNA in een vector wordt ingevoegd, het wordt gerepliceerd in een gastheerbacterie en er worden cellen of organismen geproduceerd die exacte kopieën zijn van de genetische samenstelling. Subklonen is een techniek waarbij het gen van belang, dat al in een vector is ingebracht, in een secundaire vector wordt ingebracht, replicatie ervan in een gastheerbacterie en productie van genetisch identieke kopieën van cellen of organismen. Het belangrijkste verschil tussen klonen en subklonen is dat, bij klonen, het gen van belang, eenmaal geligeerd in een vector, het kloneringsproces voortzet, terwijl, bij subklonering, het reeds gekloonde gen van belang wordt gescheiden van de oudervector en opnieuw ingevoegd in een ontvanger vector en ga verder met het proces.
Wat is klonen?
Klonen is de procedure die genetisch identieke organismen of cellen produceert. In de natuur gebeurt klonen via ongeslachtelijke voortplanting. Wanneer er geen genetische recombinatie of wijziging is, krijgen dochtercellen dezelfde genetische samenstelling van de ouder. Prokaryote en eukaryote organismen creëren klonen door binaire splitsing, knopvorming, mitose, enz. In de moleculaire biologie is het klonen van genen of specifieke DNA-fragmenten een populaire methode om de structuur en functie van dat specifieke DNA-gedeelte te bestuderen.
Het belangrijkste doel van moleculair klonen is om miljoenen kopieën te maken van genetisch identieke cellen of organismen die het DNA-fragment van belang dragen (voornamelijk genen). Het creëert organismen met exacte genetische kopieën van een ander. In de eerste plaats worden specifieke genen gekloond in moleculaire studies om structurele en functionele informatie te verkrijgen en voor DNA-sequencing. Ook voor de productie van specifieke eiwitten of producten op grote schaal wordt klonen veel gebruikt.
Kloonprocedure
De basisstappen van de kloonprocedure zijn als volgt.
- Identificatie en isolatie van het gen van belang. (Amplificatie van het gen van interesse door PCR).
- Restrictie-digestie van het gen van belang (Restrictie-endonuclease sneed het gen af).
- Restrictiedigestie van het vector-DNA. (Vector-DNA wordt ook geknipt met dezelfde restrictie-endonuclease).
- Invoeging van het gen in de vector en vorming van het recombinante molecuul.
- Transformatie van de recombinante vector in een gastheerbacterie.
- Isolatie en identificatie van de getransformeerde bacteriën (plasmidevector moet een selecteerbaar gen bevatten, meestal een antibioticumresistentiegen om getransformeerde bacteriën te screenen).
- Recombinante genexpressie binnen de gastheer.
Figuur_01: Kloonprocedure
Wat is subklonen?
Subklonen is een procedure voor het verplaatsen van een gen van belang van de ene vector naar een andere vector om de expressie van het gen te zien om de gewenste functionaliteit van het gen te verkrijgen. Bij deze methode zijn twee vectoren betrokken; namelijk oudervector en bestemmingsvector. Gekloneerde inserts worden bij subklonering weer naar een tweede vector verplaatst. Het doel van het overbrengen van het gen van de eerste vector naar de tweede vector is om iets te verkrijgen dat niet door de eerste vector kon worden gedaan of om een gen opnieuw te scheiden binnen het reeds gekloonde fragment van DNA en het alleen tot expressie te brengen. In het begin worden in deze procedure restrictie-enzymen gebruikt.
Subkloneringsprocedure
De basisstappen van subklonen zijn als volgt.
- Met behulp van restrictie-endonucleasen, scheiding van het DNA van belang in het donorplasmide (oudervector).
- Amplificatie van het DNA van belang met behulp van PCR.
- Zuivering van het PCR-product (DNA van belang) door gelelektroforese.
- Opening van het ontvangende plasmide door dezelfde restrictie-endonucleasen die worden gebruikt om het van belang zijnde DNA in het ouderplasmide te scheiden.
- Ligatie van het DNA van belang (gen) in het ontvangende plasmide om het gesubkloneerde plasmide te creëren.
- Transformatie van de gesubkloneerde vector in een competente gastheerbacterie.
- Screening van getransformeerde cellen.
- Zuivering van het plasmide-DNA en gebruik voor DNA-sequencing of expressie van de genen om de gewenste producten te verkrijgen.
Subklonering wordt uitgevoerd bij het isoleren van één gen uit de gekloonde groep genen of wanneer het gen van belang moet worden overgebracht naar een bruikbaar plasmide om de exacte functie van het gen van belang te zien.
Figuur_02: Subkloneringsprocedure
Wat is het verschil tussen klonen en subklonen?
Klonen versus subklonen |
|
| Klonen is de procedure die genetisch identieke organismen of cellen produceert. | Subklonen is een procedure waarbij een van belang zijnd gen van de ene vector naar een andere vector wordt verplaatst om de expressie van het gen te zien om de gewenste functionaliteit van het gen te verkrijgen. |
| Proces | |
| Scheid het DNA van belang van het organisme en één keer in een vector ingevoegd en gekloond | Reeds gekloond DNA wordt gescheiden van de eerste vector en ingevoegd in een tweede vector en gekloond. |
| Voeg beweging in via vectoren | |
| Verplaatst geen inserts (DNA van belang) van de ene vector naar een andere vector. | Verplaats invoegingen van bovenliggende vector naar bestemmingsvector. |
Samenvatting – Klonen versus subklonen
Klonen creëert genetisch identieke cellen of organismen met het geïnsereerde gen of DNA van belang. Het gaat door de scheiding en insertie van het DNA van belang in een vector en expressie in een gastheerbacterie. Subklonen deelt vergelijkbare stappen met klonen. Bij subklonering wordt echter een reeds gekloond DNA-fragment (gen van belang) in een vector ingevoegd en in een gastheerbacterie getransformeerd. Dat is het belangrijkste verschil tussen klonen en subklonen.
