Belangrijk verschil – RT PCR vs QPCR
Polymerase Chain Reaction is een techniek die wordt gebruikt om een specifiek DNA-gebied in vitro te amplificeren. Dankzij de uitvinding van deze techniek door Kary Mullis in 1983, zijn wetenschappers in staat duizenden tot miljoenen kopieën te maken van specifieke DNA-fragmenten voor onderzoeksdoeleinden. Momenteel is het een veel voorkomende en routinematig uitgevoerde techniek geworden in klinische en onderzoekslaboratoria voor een breed scala aan toepassingen. Er zijn variaties op de traditionele PCR-techniek zoals RT PCR, geneste PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT – QPCR, enz. RT PCR en Q PCR zijn twee belangrijke variaties van PCR. Het belangrijkste verschil tussen RT PCR en Q PCR is dat RT PCR wordt gebruikt om genexpressie te detecteren door het creëren van complementaire DNA (cDNA) transcripten van RNA, terwijl Q PCR wordt gebruikt om de PCR-producten in re altime kwantitatief te meten met behulp van fluorescerende kleurstoffen.
Wat is RT PCR?
Reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) is een variant van PCR die wordt gebruikt om RNA-expressie te detecteren. Het is een zeer belangrijke methode voor het detecteren van mRNA-expressie in weefsels. RT PCR wordt gebruikt wanneer het uitgangsmateriaal van het monster RNA is. Bij RT PCR wordt het matrijs-mRNA eerst omgezet in complementair DNA. Deze stap wordt gekatalyseerd door het enzym reverse transcriptase en het proces staat bekend als reverse transcriptie. Ten tweede wordt traditionele PCR gebruikt voor het nieuw gesynthetiseerde cDNA voor de amplificatie.
RT PCR is een zeer gevoelige techniek waarvoor een relatief kleine hoeveelheid RNA-monster nodig is. RT PCR wordt vaak gebruikt bij de diagnose en kwantificering van RNA-soorten, met name RNA-virussen zoals het humaan immunodeficiëntievirus en het hepatitis C-virus.
Figuur 01: RT PCR-techniek
Wat is QPCR?
Kwantitatieve PCR (QPCR) is een variant van PCR die wordt gebruikt om de PCR-producten kwantitatief te meten. Het wordt ook wel re altime polymerasekettingreactie genoemd, omdat het de amplificatie van re altime meet met behulp van een re altime PCR-machine. Het is een geschikte methode om de hoeveelheid van een doelsequentie of gen in een monster te bepalen. Het interessante kenmerk van QPCR is dat het zowel versterking als echte kwantificering in één stap combineert. Daarom kan de noodzaak van gelelektroforese bij detectie worden geëlimineerd door de QPCR-techniek. QPCR gebruikt fluorescerende kleurstoffen om PCR-producten te labelen tijdens de PCR-reacties die uiteindelijk leiden tot directe kwantificering. Wanneer de PCR-producten zich ophopen, worden ook de fluorescerende signalen geaccumuleerd en deze worden gemeten door de real-time machine. QPCR kan worden gecombineerd met RT PCR. Het staat bekend als RT – QPCR of QRT – PCR en wordt beschouwd als de meest krachtige, gevoelige en kwantitatieve methode voor de detectie van RNA-niveaus in de cellen of weefsels.
SYBR Green en Taqman zijn twee methoden die worden gebruikt om het amplificatieproces van de re altime PCR te detecteren of te bekijken. De SYBR Green-methode wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescerende kleurstof genaamd SYBR-groen en detecteert de amplificatie door de kleurstof te binden om dubbelstrengs DNA te produceren. Taqman wordt uitgevoerd met behulp van dubbel gelabelde sondes en detecteert de amplificatie door afbraak van de sonde door Taq-polymerase en afgifte van de fluorofoor zoals weergegeven in figuur 02. Beide methoden volgen de voortgang van het amplificatieproces en rapporteren de hoeveelheid van het product re altime.
Real-time PCR heeft een breed scala aan toepassingen, zoals kwantificering van genexpressie, microRNA- en niet-coderende RNA-analyse, SNP-genotypering, detectie van kopienummervarianten, detectie van zeldzame mutaties, detectie van genetisch gemodificeerde organismen, detectie van infectieuze agentia, enz.
Figuur 02: Kwantitatieve PCR-techniek
Wat is het verschil tussen RT PCR en QPCR?
RT PCR versus QPCR |
|
| RT PCR is een techniek die wordt gebruikt om genexpressie te detecteren door middel van amplificatie. | QPCR is een techniek die DNA versterkt en de PCR-producten in re altime kwantificeert. |
| Betrokkenheid van reverse transcriptase-enzym | |
| Enzym reverse transcriptase wordt gebruikt voor RT PCR. | Enzym reverse transcriptase wordt niet gebruikt voor QPCR. |
| Gebruik van fluorescerend gelabelde moleculen | |
| Fluorescerend gelabelde kleurstoffen of probes worden niet gebruikt voor RT PCR. | Fluorescerend gelabelde kleurstoffen of probes worden gebruikt voor QPCR. |
| Kwantificering van PCR-product | |
| Tenzij in combinatie met QPCR, kwantificeert RT PCR het PCR-product niet. | QPCR meet het PCR-product kwantitatief. |
| Beginmateriaal | |
| Uitgangsmateriaal is mRNA. | Uitgangsmateriaal is DNA. |
| Synthese van cDNA | |
| Complementair DNA wordt geproduceerd tijdens de RT PCR. | Complementair DNA wordt niet geproduceerd tijdens QPCR. |
Samenvatting – RT PCR vs QPCR
RT PCR en QPCR zijn twee versies van traditionele PCR. RT PCR-techniek wordt uitgevoerd voor mRNA-monsters en wordt aangedreven door reverse transcriptie en productie van cDNA. QPCR wordt gebruikt om PCR-producten te kwantificeren tijdens de re altime PCR-thermische cycli met behulp van fluorescerende kleurstoffen of gelabelde sondes. In QPCR wordt de hoeveelheid PCR-product weergegeven door de uitgezonden fluorescerende signalen van het monster. RT PCR wordt in de volksmond gebruikt als een amplificatieproces, terwijl QPCR vaak wordt gebruikt als een kwantificatieproces. Dit is het verschil tussen RT PCR en QPCR.
