Het belangrijkste verschil tussen chromatofocusing en iso-elektrische focussering is dat chromatofocusing een soort kolomchromatografiemethode is die gebruik maakt van ionenuitwisselingsharsen, terwijl iso-elektrische focussering een soort elektroforesetechniek is die gebruik maakt van geïmmobiliseerde pH-gradiëntgels.
Chromatofocussering en iso-elektrische focussering zijn twee technieken die eiwitten scheiden op basis van hun iso-elektrische punten. Zowel chromatofocussering als iso-elektrische focussering hebben een groot oplossend vermogen. Chromatofocusing is een kolomchromatografiemethode met hoge resolutie, terwijl iso-elektrische focussering een elektroforetische scheidingsmethode is. Bovendien maakt chromatofocussering geen gebruik van een elektrisch veld, terwijl iso-elektrische focussering een elektrisch veld nodig heeft.
Wat is chromatofocus?
Chromatofocusing is een soort hoge-elutiechromatografie die eiwitten scheidt op basis van verschillen in hun iso-elektrisch punt. Het maakt gebruik van een ionenuitwisselingsharskolom en een intern ontwikkelde pH-gradiënt. In tegenstelling tot iso-elektrische focussering, houdt chromatofocusing geen elektrisch veld in. Chromatofocusing is een krachtige zuiveringstechniek die zeer vergelijkbare moleculen kan oplossen, zelfs als ze slechts 0,02 pH-eenheden verschillen. Daarom is chromatofocusing het meest geschikt als laatste polijststap wanneer een hoge resolutie vereist is bij het scheiden van zeer vergelijkbare componenten.
Bij chromatofocusing wordt het monster op de kolom aangebracht door het te mengen met de startbuffer. Eiwitten met een pH boven hun iso-elektrisch punt zijn negatief geladen en blijven dicht bij de top van de kolom, terwijl andere eiwitten met een pH onder hun iso-elektrische punt door de kolom naar beneden migreren. Het eiwit met het hoogste iso-elektrische punt wordt als eerste geëlueerd, terwijl het eiwit met het laagste iso-elektrische punt als laatste uit de kolom wordt geëlueerd. Deze techniek wordt beïnvloed door verschillende factoren, zoals eiwitprecipitatie en lineariteit van de pH-gradiënt.
Wat is iso-elektrisch scherpstellen?
Iso-elektrische focussering is een techniek die verschillende moleculen scheidt op basis van hun iso-elektrisch punt. Het wordt ook wel elektrofocussering genoemd. Deze techniek wordt vaak gebruikt voor eiwitscheiding in een gel. Bij iso-elektrisch focusseren wordt het monster toegevoegd aan geïmmobiliseerde pH-gradiënt (IPG) gels. IPG-gel is een acrylamidegelmatrix gecopolymeriseerd met een pH-gradiënt. De eiwitten migreren naar de kathode totdat ze het pH-gebied van hun iso-elektrische punten hebben gevonden. Wanneer een eiwit de pH bereikt die geen nettolading heeft, stopt de migratie en ontstaat er een stationaire band. Evenzo geeft elk eiwit een band op een punt in de pH-gradiënt die overeenkomt met zijn iso-elektrische punt.
Figuur 01: Iso-elektrisch scherpstellen
Iso-elektrische focussering is de eerste stap van tweedimensionale gelelektroforese. Bij die techniek worden eiwitten eerst gescheiden volgens hun iso-elektrische punten door iso-elektrische focussering en vervolgens gescheiden door hun molecuulgewicht via SDS-PAGE.
Wat zijn de overeenkomsten tussen chromatofocusing en iso-elektrische focussering?
- Chromatofocussering en iso-elektrische focussering zijn twee zeer oplossende methoden.
- Beide zijn gebaseerd op het iso-elektrische punt van eiwitten.
- Deze technieken gebruiken een pH-gradiënt.
- Beide procedures zijn informatief voor de karakterisering van humane hemoglobinevarianten.
- Ze kunnen moleculen oplossen waarvan de pI-waarden slechts 0,02 pH-eenheden verschillen.
Wat is het verschil tussen chromatofocusing en iso-elektrische focussering?
Chromatofocusing is een kolomchromatografietechniek met hoge resolutie die eiwitten scheidt op basis van hun iso-elektrisch punt. Iso-elektrische focussering daarentegen is een elektroforetische techniek die eiwitten scheidt op basis van hun iso-elektrische punt door het aanleggen van een elektrisch veld langs een pH-gradiënt gevormd in een capillair. Dit is dus het belangrijkste verschil tussen chromatofocussing en iso-elektrische focussering.
Een ander verschil tussen chromatofocusing en iso-elektrische focussering is dat chromatofocusing geen elektrisch veld omvat, terwijl iso-elektrische focussering een elektrisch veld nodig heeft.
Samenvatting – Chromatofocusing versus iso-elektrische focus
Chromatofocussering en iso-elektrische focussering zijn twee vergelijkbare technieken met een hoog oplossend vermogen van moleculen, vooral zeer vergelijkbare moleculen. Chromatofocusing is een kolomchromatografietechniek met hoge resolutie, terwijl iso-elektrische focussering een elektroforesemethode is. Bij chromatofocussering is geen elektrisch veld betrokken, in tegenstelling tot iso-elektrische focussering. Dit vat dus het verschil samen tussen chromatofocussering en iso-elektrische focussering.
